微生物學(xué)目的與要求內(nèi)容(存儲版)
【正文】 以下比例配成。④孵育72小時后將雞胚置4℃冰箱過夜，目的是使雞胚凍死并不易在收獲尿囊液時出血，注意放入冰箱時必須使天然氣室（大頭）朝上。2．雞紅血球的制備 ％枸櫞酸鈉1ml，迅速混合，存放于4℃冰箱，時間不超過3天，使用前取紅細(xì)胞懸液加5～10倍體積生理鹽水洗滌3次，最后一次以2000轉(zhuǎn)/分的速度沉淀10分鐘，％懸液備用。不奮斗就是每天都很容易，可一年一年越來越難。是狼就要練好牙，是羊就要練好腿。（一般補體結(jié)合試驗所用抗原多為可溶性抗原，具有型的特異性；血凝試驗中抗原為顆粒性，具有株的特異性；補體結(jié)合試驗所用的血清以豚鼠制備的免疫血清為宜）。②取10～12日齡雞胚一只，接種于雞胚尿囊（初次分離多用羊膜腔接種，此處由于初學(xué)，羊膜腔接種難以掌握，暫以尿囊接種代替）。H2O 2克 CaCl2 將上述二溶液混合后加雙蒸水至1000毫升，加2毫升氯仿作為防腐劑，保存于4℃冰箱。氣室的功能是呼吸和調(diào)節(jié)壓力，殼膜之下為血管豐富的絨毛尿囊膜，外為絨毛膜，系外胚層形成，內(nèi)為尿囊膜，由內(nèi)胚層形成，兩膜結(jié)合之間為中胚層，因此絨毛尿囊膜是尿囊膜在生長發(fā)育過程中與絨毛膜相連而成，血管較多，起著胚胎呼吸器官的功能，氧氣的交換是在膜的血管內(nèi)通過卵殼孔而進行的。附錄：附錄：1．雞胚的準(zhǔn)備和發(fā)育過程 病毒的雞胚培養(yǎng)，多采用來亨雞卵，其優(yōu)點為卵殼色白而薄，易于照視，如不能得到，一般家雞卵也可應(yīng)用。 （二）血凝抑制試驗 【材料】 4個血凝單位的病毒液，1∶5稀釋的抗血清，32孔有機玻璃板， ml移液器，移液頭，％雞紅細(xì)胞懸液，生理鹽水 【方法】 按下表進行，其操作程序為： 1．將有機玻璃板孔從1～10號進行編號，從第一孔起直至第9孔。第10孔不加尿囊液作為對照。4．取出細(xì)胞在低倍顯微鏡下觀察，注意種毒與對照二管的細(xì)胞形態(tài)，排列等。2．％胰蛋白酶，37℃孵育1分鐘。有一些傳代細(xì)胞對病毒敏感范圍較廣，曾被利用作病毒的分離和鑒定。依同法再洗滌2次，將血球充分洗去。細(xì)胞培養(yǎng)法多應(yīng)用于病毒的分離培養(yǎng)，進行血清中和試驗及制造疫苗和抗原等方面。用過的注射器煮沸消毒處理。8．左手用小鑷子鑷起絨毛尿囊膜，右手用小剪順卵殼四周剪下絨毛尿囊膜放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，并用無菌生理鹽水洗滌1～2次，再將膜張開，膜上牛痘斑就看得更為清楚。注意：已磨好之雞胚必須于1～2小時內(nèi)接種，否則絨毛尿囊膜易與卵殼粘著。 6．注射后次日，逐日觀察雞胚生活情況，孵育48～72小時后移入4℃冰箱。絨毛尿囊膜區(qū)血管豐富，在照視時呈現(xiàn)紅色，幾乎占據(jù)雞蛋的二分之一。 本法適用于一些腦炎病毒的分離培養(yǎng)。小白鼠：3周齡，體重6～8克。注意麻醉深度，不宜太淺或太深，太深時易遭致麻醉死亡或非特異性吸入性肺炎，太淺則易在滴種時打噴嚏。 2. 尾背和左右兩側(cè)三根血管皆為靜脈，可選一根擴張較好的靜脈作接種用。 （二）狂犬病病毒內(nèi)基（Negri）包涵體（示教） 用高倍鏡或油鏡觀察經(jīng)HE（蘇木紫伊紅染色）染色的死于狂犬病的犬腦組織切片，注意包涵體在細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)、位置及染色性。（二）掌握病毒的形態(tài)并了解病毒包膜的獲得。 常用的實驗動物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、綿羊、雞、猴等。 注意：推注時遇阻力且皮下隆起發(fā)白時，表示針頭不在血管內(nèi)應(yīng)拔出重新進針；如針頭在血管內(nèi)，推注時不感阻力，且可看到血管中血液由于注入液體而后退。將懸滴靠近動物鼻尖，動物在呼吸時自然吸入，～，不宜過多。 2. 取出小白鼠，左手將小白鼠固定，固定時用大拇指和食指捏住小白鼠的頭部，左手手掌輕輕按住小白鼠的體部。 常用的雞胚接種方法有四種，即絨毛尿囊膜上接種法、羊膜腔接種法、尿囊接種法及卵黃囊接種法。 4．將雞胚橫臥于蛋架上，用無菌1毫升注射器抽取病毒液體，針頭于卵殼成30176。 8．滴定尿囊液的病毒血凝效價。4．立即用橡皮乳頭在天然氣室一端小孔吸氣2～3次，目的將天然氣室的空氣吸去，而上面所開的洞口進入空氣，形成一個人工氣室，可在照蛋燈上照視一下，看天然氣室是否消失，如未消失則尚需再吸氣數(shù)次（圖102）?！痉椒ā?．所用雞胚在使用前一天，將雞胚直立卵盤培養(yǎng)，使其胚胎向上，便于操作。收獲病毒之前將雞胚移入普通冰箱18～24小時，將雞胚凍死，以減少收獲時的出血。能引起病變的組織細(xì)胞，往往取自病毒的自然宿主，特別是引起疾病的宿主的某些臟器組織細(xì)胞。經(jīng)四層紗布過濾后的細(xì)胞懸液，低速離心沉淀（1000轉(zhuǎn)/分以內(nèi)）5分鐘，吸取上清液，沉淀物加入適量營養(yǎng)液，用白細(xì)胞計數(shù)的方法進行計數(shù)，使成每毫升含50～80萬細(xì)胞懸液以作單層細(xì)胞培養(yǎng)。Hep－2細(xì)胞也曾用來分離脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A組病毒、腺病毒、RS病毒。5．用生長液按原量3～4倍稀釋，即一瓶細(xì)胞能傳3～4瓶。 血凝抑制試驗適用于具有血凝素的病毒，試驗必須預(yù)先滴定病毒的血凝效價，然后采用一定量的病毒，通常是加入4個血凝單位的病毒，在與血凝滴定試驗相同的反應(yīng)條件下來進行測定。孔 號12345678910生 理 鹽 水（ml）尿 囊 液（ml）+ *++++++++病 毒 稀 釋 度1∶1 01∶2 01∶4 01∶8 01∶1601∶3201∶6401∶12801∶2560
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