【正文】 Hg），再充入無(wú)氧氮?dú)?，反?fù)三次，最后充入80%N10%H2和10%CO2混合氣體，若缸內(nèi)呈無(wú)氧狀態(tài)，則指示劑美藍(lán)為無(wú)色。（4）平皿焦性沒(méi)食子酸法：（也可用Na2CO3）的比例，先將焦性沒(méi)食子酸放入平皿蓋背面的滅菌紗布中，再滴入NaOH，立即將接種細(xì)菌的平板扣上，用熔化的石蠟密封平皿和平皿蓋的縫隙，置35℃溫箱培養(yǎng)。該箱可調(diào)節(jié)溫度，本身是孵箱或?qū)⒎跸涓皆谄鋬?nèi)。因來(lái)源相同，同一個(gè)菌落的細(xì)菌為純種細(xì)菌。2．培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水、葡萄糖發(fā)酵管、蛋白胨水、硫酸亞鐵（或醋酸鉛）半固體培養(yǎng)基、西蒙氏或柯氏培養(yǎng)基等。通過(guò)觀察培養(yǎng)基顏色變化以及氣體的有無(wú)即可鑒別細(xì)菌。 臨床應(yīng)用： 可用于多種細(xì)菌的鑒別。（2）方法：1）接種環(huán)取細(xì)菌接種于葡萄糖蛋白胨水，置35℃培養(yǎng)48h。（4）注意事項(xiàng)：靛基質(zhì)試劑具有較強(qiáng)的腐蝕性，使用時(shí)應(yīng)小心，勿滴落至皮膚、衣服或其他物品上。 2．方法：用接種針挑取待測(cè)細(xì)菌穿刺于枸櫞酸鈉培養(yǎng)基并抽出于斜面劃線接種，置35℃，18~24h培養(yǎng)。（4）注意事項(xiàng)：培養(yǎng)基內(nèi)不能含有血液，也不宜用血平板上的菌落，否則會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性；陳舊培養(yǎng)物上的酶可能失活，所以細(xì)菌培養(yǎng)物要新鮮；臨床應(yīng)用：常用于葡萄球菌和鏈球菌屬間鑒別，前者為陽(yáng)性，后者為陰性。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。2．試劑：%碘酊、75%酒精。待瓊脂凝固后，將其放入35℃，培養(yǎng)18~24h。二、消毒滅菌試驗(yàn)1．皮膚消毒試驗(yàn)（1）取普通平板1個(gè)，用記號(hào)筆在平板底部將其劃分三格，并分別注明“消毒前”和“消毒后”和“對(duì)照”。3．干熱滅菌法（1）儀器：干烤箱構(gòu)造：為一填充有絕熱材料的雙層金屬箱。4．高壓蒸汽滅菌法（1）儀器：直立式高壓滅菌器（或手提式）構(gòu)造：高壓滅菌器為一雙層圓桶形的金屬鍋，外桶長(zhǎng)而堅(jiān)厚，耐高壓；內(nèi)桶短而薄，用以裝載滅菌物品。2）加熱 接通電源，開(kāi)始加熱。3）冷空氣必須排盡，但溫度并沒(méi)有達(dá)到121℃，影響滅菌效果，達(dá)不到徹底滅菌的目的。②留點(diǎn)溫度計(jì)法：滅菌后看溫度是否達(dá)到滅菌所需溫度。波長(zhǎng)在200~300nm的紫外線有此殺菌作用，其中以265~266殺菌作用為最強(qiáng)。2） 紫外燈殺菌的有效距離為2~3m。市場(chǎng)有售，但生產(chǎn)廠家須獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）批準(zhǔn)。在紙片周圍，一定濃度的藥物抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)從而形成了透明的抑菌環(huán)，抑菌環(huán)的大小則反映了待測(cè)菌對(duì)該種藥物的敏感程度。紙片放置要均勻，各紙片中心距離不小于24mm，紙片距平板邊緣的距離應(yīng)不小于15mm。藥物紙片應(yīng)始終保存在封閉、冷凍、干燥的環(huán)境，否則會(huì)影響其活性。（6）抑菌環(huán)的測(cè)量要仔細(xì)、精確。（2）待測(cè)菌液的準(zhǔn)備：分純的平板上挑取4~5個(gè)菌落，接種于3~5ml MH肉湯中35℃培養(yǎng)4~6h，與標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，再用MH肉湯按1∶200稀釋，并在15min內(nèi)接種。4．注意事項(xiàng)（1）培養(yǎng)基的pH、滲透壓和電解質(zhì)均可影響試驗(yàn)結(jié)果。6．臨床意義：多用于抗菌藥物抗菌效力的測(cè)定，新藥開(kāi)發(fā)。（1）原理：同紙片擴(kuò)散法。2．腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（extended spectrum βlactamase,ESBLs）是指能水解青霉素類和頭孢菌素類抗生素并擴(kuò)展到能水解第三、第四代頭孢菌素以及單環(huán)類抗生素并由質(zhì)粒介導(dǎo)的β內(nèi)酰胺酶。3）結(jié)果判斷： 頭孢泊肟抑菌環(huán)直徑≤17mm 頭孢他啶抑菌環(huán)直徑≤22mm 氨曲南抑菌環(huán)直徑≤27mm 頭孢噻肟抑菌環(huán)直徑≤27mm 頭孢曲松抑菌環(huán)直徑≤25mm符合以上任何一項(xiàng)即可認(rèn)為該菌能產(chǎn)ESBLs。苯唑西林紙片法結(jié)果需對(duì)著透射光線觀察，抑菌環(huán)內(nèi)有任何可辨別的細(xì)菌生長(zhǎng)即為苯唑西林耐藥。MRSA從1961年發(fā)現(xiàn)至今幾乎遍及全球，已成為院內(nèi)感染的重要病原菌之一。5．質(zhì)量控制：每次試驗(yàn)應(yīng)選用金黃色葡萄球菌ATCC2592大腸埃希菌ATCC2592糞腸球菌ATCC29212和銅綠假單胞菌ATCC27853等標(biāo)準(zhǔn)菌株在相同條件下作平行試驗(yàn)。并以MIC報(bào)告之。2．方法（1）抗菌藥物原液的配制：試驗(yàn)用的抗菌藥物應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)的粉劑，選擇適宜的溶劑和稀釋劑進(jìn)行溶解和稀釋（表72），并配成一定濃度（通常為1000U或1000μg/ml）的藥物原液。平板的堆放不超過(guò)2塊，防止受熱不均。制備平板時(shí)，注意其厚度并且厚薄要均勻。角，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，蓋上平板，室溫下置3~5min待瓊脂表面的水分稍干。：無(wú)菌生理鹽水、無(wú)菌棉簽、無(wú)菌試管、酒精燈、鑷子、生物安全柜、培養(yǎng)箱等。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)要求高的細(xì)菌，則需在MH培養(yǎng)基中加入其它營(yíng)養(yǎng)成分。（4）注意事項(xiàng)：1）作室內(nèi)空氣消毒時(shí)，通常事先關(guān)閉室內(nèi)的門(mén)、窗，打開(kāi)紫外燈之后隨即離開(kāi)，讓其照射30min。（4）適用范圍：耐高溫、高壓的物品，如金屬器械、玻璃器皿、生理鹽水、棉纖等的高壓滅菌。檢測(cè)方法如下：①化學(xué)指示法：利用化學(xué)指示劑在一定溫度與作用時(shí)間條件下受熱變色或變形的特點(diǎn)，以判斷是否達(dá)到滅菌所需溫度。整個(gè)過(guò)程，必須嚴(yán)格按照操作規(guī)程由專人操作，避免意外事故發(fā)生，確保安全。將準(zhǔn)備滅菌的物品包扎好，裝入高壓鍋的內(nèi)桶中，物品放置不宜過(guò)多、過(guò)擠。2）結(jié)束時(shí)，關(guān)閉電源，必須等箱內(nèi)的溫度降下與外面溫度相當(dāng)時(shí)才可打開(kāi)箱門(mén)取出物品，防止玻璃器皿爆裂和灼傷。另外的2管不加熱作對(duì)照。3）培養(yǎng) 寫(xiě)上標(biāo)記，將平板放35℃，18~24h培養(yǎng)。2）用無(wú)菌吸管吸取1ml水樣以無(wú)菌技術(shù)加入無(wú)菌平皿中。方法3：試劑紙片法，先將濾紙浸泡于試劑中制成試劑紙條，試驗(yàn)時(shí)揩取菌落涂于試劑紙上。方法2：挑取一環(huán)菌落置于清潔的載玻片上，滴加3%過(guò)氧化氫溶液數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。三、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)1．原理：某些細(xì)菌（如產(chǎn)氣腸桿菌等）能利用培養(yǎng)基中的枸櫞酸鈉作為唯一的碳源，利用培養(yǎng)基中的磷酸二氫銨（銨鹽）作為唯一的氮源，在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。2）取出，滴加數(shù)滴靛基質(zhì)試劑于培養(yǎng)基的液面上，靜置半分鐘觀察結(jié)果。3．VP（VogesProskauer）試驗(yàn)（伏普試驗(yàn)） （1）原理：某些細(xì)菌（如產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌）將葡萄糖分解成丙酮酸之后，能進(jìn)一步使丙酮酸脫羧生成中性的乙酰甲基甲醇，后者在堿性環(huán)境中被空氣中的氧氧化成二乙酰，二乙酰與蛋白胨中所含精氨酸的胍基發(fā)生反應(yīng)生成紅色的化合物。3）發(fā)酵管也可以制成液體的，但需在試管中加入一支小倒管以觀察產(chǎn)氣情況，并可以選用不同的指示劑。一、糖（醇、苷）的分解代謝試驗(yàn)1．葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn) （1）原理：將大腸埃希菌和傷寒沙門(mén)菌分別接種于半固體的葡萄糖發(fā)酵管中，經(jīng)37℃1824h培養(yǎng)，大腸埃希菌因?yàn)榉纸馄渲械钠咸烟亲罱K產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。3．了解生化反應(yīng)在細(xì)菌鑒定及診斷中的重要意義。觀察要點(diǎn)：注意觀察穿刺線是否清晰、周圍的培養(yǎng)基是否混濁。使用時(shí)將物品放入箱內(nèi)，先打開(kāi)外門(mén)，放入交換室，關(guān)上外門(mén)進(jìn)行抽氣、換氣（H2，CO2，N2）使之達(dá)到厭氧狀態(tài)，然后手伸入手套把交換室內(nèi)門(mén)打開(kāi)，將物品移入箱內(nèi)，關(guān)上內(nèi)門(mén)。使用時(shí)將接種細(xì)菌的平板放入袋中，密封袋口，先將袋中裝有化學(xué)藥品的安瓿折斷，幾分鐘后再折斷裝有美藍(lán)的安瓿，若美藍(lán)為無(wú)色則表示袋內(nèi)已處于無(wú)氧狀態(tài)，置35℃溫箱孵育。常用的方法有抽氣換氣法和氣體發(fā)生袋法。（2）燭缸法：取一有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃干燥器，在蓋及磨口處上涂上凡士林。半固體培養(yǎng)基接種時(shí)注意穿刺線要直，并沿原穿刺線退出。2）取不同稀釋度的標(biāo)本各1ml分別注入直徑90mm無(wú)菌平皿，迅速加入溶化并冷卻至約50℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂15ml，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板使之充分混勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平板。（4）在試管上做好標(biāo)記，經(jīng)35℃培養(yǎng)18~24h后觀察結(jié)果。2）同上法將平板蓋打開(kāi)約30~45176。圖43 半固體培養(yǎng)基接種法3．平板劃線接種法該法可將標(biāo)本中的多種細(xì)菌分散成單個(gè)菌落，有利于細(xì)菌的分純和進(jìn)一步鑒定。（2）左手拿試管，右手持接種環(huán)，用右手其余手指將試管塞打開(kāi)，試管口通過(guò)火焰燒灼滅菌。一般要求接種環(huán)長(zhǎng)5~8cm，直徑為2~4mm。2．掌握細(xì)菌的接種、分離培養(yǎng)方法和接種環(huán)的制作方法。（8）保存 制備好的培養(yǎng)基需注明制備日期、名稱，置4℃冰箱或冷暗處保存，但不宜放置過(guò)久。（6）滅菌 根據(jù)培養(yǎng)基的成分、性質(zhì)采用不同的滅菌方法。（4）過(guò)濾澄清 若培養(yǎng)基有混濁或沉淀，則需過(guò)濾。（3）矯正PH：用PH比色計(jì)、比色法或精密PH試紙矯正溶液的PH，~。在使用前不能隨意打開(kāi)，一經(jīng)打開(kāi)則不再認(rèn)為是無(wú)菌的。2．常用無(wú)菌器材的準(zhǔn)備（1）包裝1）平皿：用紙包好，或盛入金屬盒內(nèi)。（1）新的玻璃器材：先用肥皂水煮沸半小時(shí)，再用自來(lái)水沖洗多次，晾干水后浸于2％HCl內(nèi)數(shù)小時(shí)，將游離的雜質(zhì)除去，最后用自來(lái)水反復(fù)沖洗除盡殘余HCl后，晾干備用。無(wú)鞭毛細(xì)菌不能做真正的運(yùn)動(dòng)，但受水分子的撞擊而呈分子運(yùn)動(dòng)（布朗運(yùn)動(dòng)），即在一定范圍內(nèi)作來(lái)回顫動(dòng)，位置移動(dòng)不大，注意與細(xì)菌的鞭毛運(yùn)動(dòng)相鑒別。因此，不染色標(biāo)本檢查法主要用于觀察細(xì)菌的動(dòng)力，常用的方法有以下幾種。（2）密爾氏法1）涂片：，小鼠死亡后取腹腔液印片，自然干燥，加熱固定。1）初染：在菌膜上加石炭酸復(fù)紅染液，用微火加熱使染液冒蒸氣5min，注意不能煮沸或燒干，加熱過(guò)程中應(yīng)隨時(shí)添加染液，冷卻后水洗。（2）在玻片上加蒸餾水1滴，用接種針蘸取菌落少許，將細(xì)菌點(diǎn)在蒸餾水滴的頂部（一般只需點(diǎn)一下，僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴），使其自然流散成薄膜，不可攪動(dòng)，以免鞭毛脫落。1．細(xì)胞壁染色法（1）涂片、干燥：同革蘭染色法。4．注意事項(xiàng)：（1）涂片厚薄要適宜，以菌膜剛好能透過(guò)字跡為宜（半透明）。（3）通透性學(xué)說(shuō)：革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層較厚，含脂質(zhì)少，脫色時(shí)，乙醇不易進(jìn)入，而且95％乙醇可使細(xì)胞壁脫水，細(xì)胞壁間隙縮小，通透性降低，阻礙結(jié)晶紫和碘復(fù)合物滲出。【試劑與器材】1．菌種：葡萄球菌、大腸埃希菌。（2）裝好配對(duì)的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察。故在強(qiáng)光照射下，可在黑色的背景中看到發(fā)亮的菌體。更換接物鏡時(shí)，卸下后應(yīng)倒置在清潔的臺(tái)面上，并隨即裝入木箱的置放接物鏡的管內(nèi)。（3）油鏡的使用：低倍鏡找到物象并調(diào)至清晰之后，轉(zhuǎn)開(kāi)物鏡頭，在玻片的標(biāo)本上滴加1滴香柏油，將油鏡頭轉(zhuǎn)換至中央，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使鏡頭浸入油中，當(dāng)油鏡頭幾乎接觸玻片時(shí)停止轉(zhuǎn)動(dòng)（從側(cè)面觀察），邊觀察接目鏡邊輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器（此時(shí)只能上升鏡頭，不能下降，防止壓壞玻片及損壞物鏡），待看到模糊物象時(shí)改調(diào)細(xì)調(diào)節(jié)器，直至找到清晰物象。 2．油鏡的使用原理圖12 顯微鏡油鏡的使用原理油鏡的放大倍數(shù)高而透鏡很小，自標(biāo)本片透過(guò)的光線，因玻片和空氣的折光率不同（玻璃n=，空氣n=），部分光線經(jīng)載玻片進(jìn)入空氣后發(fā)生折射，不能進(jìn)入接物鏡，致使射入光線較少，物象不清晰。【試劑與器材】1．示教片：各種球菌、桿菌、弧菌、莢膜、鞭毛、芽胞的示教片。實(shí)驗(yàn)室傷害以及與工作有關(guān)的感染主要是由于人為失誤﹑不良實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及儀器使用不當(dāng)造成的。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)備有生物安全柜。根據(jù)以上定義，醫(yī)院內(nèi)的臨床實(shí)驗(yàn)室因接觸可能含有致病微生物的標(biāo)本，通常應(yīng)達(dá)到二級(jí)生物安全防護(hù)實(shí)驗(yàn)室要求。1．微生物的分類等級(jí)根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）出版的《實(shí)驗(yàn)室生物安全手冊(cè)》，將微生物分為四個(gè)不同危險(xiǎn)度等級(jí)：危險(xiǎn)度1級(jí)是指不能引起人或動(dòng)物致病的微生物，此類微生物無(wú)或僅具有極低的個(gè)體和群體危險(xiǎn)；危險(xiǎn)度2級(jí)的病原體具有中度個(gè)體危險(xiǎn)，低度群體危險(xiǎn)，能引起人或動(dòng)物致病，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員、社區(qū)、家畜或環(huán)境不易導(dǎo)致嚴(yán)重危害，所引起的感染具有有效的預(yù)防和治療措施，并且疾病傳播的危險(xiǎn)有限；危險(xiǎn)度3級(jí)的病原體具有高度個(gè)體危險(xiǎn)，低度群體危險(xiǎn)，通常能引起人或動(dòng)物的嚴(yán)重疾病，但一般不會(huì)發(fā)生感染的播散，并且對(duì)感染具有有效的預(yù)防和治療措施；危險(xiǎn)度4級(jí)的病原體具有高度的個(gè)體危險(xiǎn)和群體危險(xiǎn)，通常能引起人或生物的嚴(yán)重疾病，并且很容易發(fā)生個(gè)體之間的直接或間接傳播，對(duì)感染一般沒(méi)有有效的預(yù)防和治療措施。（8）離室前脫下工作服，反折放在指定的地方；雙手在2％來(lái)蘇液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗凈，方可離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。（3）非必需物品禁止帶入實(shí)驗(yàn)室，帶入實(shí)驗(yàn)室的物品應(yīng)遠(yuǎn)離操作區(qū)，放在指定的區(qū)域。微生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) 2009．7一、《微生物學(xué)檢驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?．通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證理論知識(shí)，并掌握比較全面的微生物學(xué)基本操作技術(shù)。（2）進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿工作服，必要時(shí)還須戴口罩、帽子和手套，并做好實(shí)驗(yàn)前的各項(xiàng)準(zhǔn)備工作。（7）實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)將桌面整理清潔，試劑、儀器放回原處，并用浸有消毒液的抹布將操作臺(tái)擦拭干凈，打掃衛(wèi)生，關(guān)好水、電、門(mén)窗。因此實(shí)驗(yàn)室工作人員在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須高度重視實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)，強(qiáng)化生物安全意識(shí)，熟悉生物安全防護(hù)有關(guān)知識(shí)，嚴(yán)格無(wú)菌操作。BSL4實(shí)驗(yàn)室必須與其他實(shí)驗(yàn)室隔離，并具備特殊的空氣和廢物處理系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)操作須在Ⅲ級(jí)生物安全柜內(nèi)或全身穿戴特制的正壓防護(hù)服。（7）在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)穿戴隔離衣、帽、手套，必要時(shí)戴防護(hù)眼鏡。4．實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)生物危險(xiǎn)實(shí)驗(yàn)室生物污染的途徑包括：空氣傳播（臨床標(biāo)本中的污染源在空氣中傳播、微生物氣溶膠的吸入）、直接傳播（工作中偶然刺傷、割傷，碎玻璃劃傷直接感染）、皮膚粘膜接觸（臨床標(biāo)本中的傳染源通過(guò)破損皮膚粘膜接觸造成的感染）、其他不明原因的實(shí)驗(yàn)室相關(guān)感染。3．掌握光學(xué)顯微鏡油鏡的使用和維護(hù)方法，了解熒光顯微鏡和暗視野顯微鏡的構(gòu)造和使用方法。（3）油鏡：鏡頭標(biāo)志為100或 100/，鏡頭最長(zhǎng)，其上常刻有白色環(huán)圈，或“oil”字樣。用左眼觀察接目鏡，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使載物臺(tái)下降，待看到模糊的圖像時(shí)，再調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)節(jié)器，直至看到清晰的圖像為止。（4）接目鏡和接物鏡不要隨便卸下，必須抽取接目鏡時(shí)，須將鏡筒上口用布遮蓋，避免灰塵落入鏡筒內(nèi)。這樣，從聚光器周邊斜射到載玻片上細(xì)菌等微粒上的光線，就因散射作用而發(fā)出亮光，反射到鏡簡(jiǎn)內(nèi)。2．熒光顯微鏡