【正文】 應(yīng)結(jié)果如何？（3）沙門氏菌屬檢測主要包括哪幾個主要步驟？實驗6 食品中志賀氏菌屬的檢驗1 目的要求（1）了解志賀氏菌的形態(tài)、培養(yǎng)以及生化反應(yīng)等特性。單菌相不必作位相變異檢查。不常見的菌型，先用144種沙門氏菌因子血清中的6種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查以確定第1相或第2相的H抗原。被A—F多價O血清凝集者，依次用OOOOOOO和O11因子血清作凝集試驗，根據(jù)試驗結(jié)果判定O群。O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的(如2．5～3％)培養(yǎng)基上再檢查，如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反應(yīng)時，可挑取菌苔于lmL生理鹽水中作成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。必要時按表32—4，進行沙門氏菌屬亞屬Ⅲ或其它亞屬的鑒定.表323 附3賴氨酸烏氨酸ONPG水楊苷棉子糖動力判定結(jié)果＋＋－－－＋沙門氏菌屬－－－－－－志賀氏菌屬－＋＋－－－宋內(nèi)氏志賀氏菌屬dd＋ddd埃希氏菌屬注：判定結(jié)果時應(yīng)注意傷寒沙門氏菌鳥氨酸陰性，甲型副傷寒沙門氏菌賴氯酸陰性，雞沙門氏菌無動力。如尿素、KCN和賴氨酸三項中有一項異常、按表32—3附1仍可判定為沙門氏菌。斜面產(chǎn)酸與產(chǎn)氣與否均不限。4．5生化試驗在接種三糖鐵的同時，再接種蛋白胨水(供作靛基質(zhì)試驗)、尿素（）瓊脂、KCN培養(yǎng)基和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各一管，于36177。4．4三糖鐵高層瓊脂初步鑒別挑選上述選擇性瓊脂平板上的可疑菌落，接種到三糖鐵瓊脂斜面試管中，于36177。HE瓊脂藍綠色或藍色，多數(shù)菌株產(chǎn)H2S，菌落中心黑色或幾乎全黑色。檢樣勻液25ml+MM（或TTB）100mlBSDHL(或HE、WS、SS)挑取可疑菌落TSI（斜面、底面、產(chǎn)氣、H2S），蛋白胨水（靛基質(zhì)），尿素（），KCN，賴氨酸H2S+，靛基質(zhì)－ 尿素－，KCN－賴氨酸＋H2S+，靛基質(zhì)＋ 尿素－，KCN－賴氨酸＋H2S－，靛基質(zhì)－ 尿素－，KCN－賴氨酸＋/－非如左述的各種反應(yīng)結(jié)果甘露醇、山梨醇沙門氏菌血清學試驗ONPG非沙門氏菌沙門氏菌血清學試驗非沙門氏菌報 告檢樣勻25ml＋SC100ml（或TTB）100ml圖321 沙門氏菌屬檢驗程序表321 沙門氏菌屬各亞屬在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ亞屬Ⅲ（即亞利桑那菌）亞硫酸 瓊脂產(chǎn)H2S菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色、菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；有些菌株不產(chǎn)生H2S，形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變色。１℃18～24h18～24h36177。1℃分別培養(yǎng)18～24h(DHL、HE，SS)或40～48h(BS)。各取25mL加入滅菌生理鹽水225mL，按前法做成檢樣勻液，取其半量接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)于42℃培養(yǎng)24h，另半量接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于36177。1℃培養(yǎng)4h(干蛋品需培養(yǎng)18～24h)，移取10mL轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18～24h。P試劑)，丙二酸鈉培養(yǎng)基，氧化酶試劑，革蘭氏染色液，26種(初步分型)、57種(一般分型)、144種(詳細分型)沙門氏菌因子血清。根據(jù)沙門氏菌屬的生化特征，借助于三糖鐵、靛基質(zhì)，尿素、KCN，賴氨酸等試驗可與腸道其它菌屬相鑒別。為了分離與檢測食品中的沙門氏菌，對某些加工食品必須經(jīng)過前增菌處理，用無選擇性的培養(yǎng)基使處于頻死狀態(tài)的沙門氏菌恢復(fù)其活力，再進行選擇性增菌，使沙門氏菌得以增殖而大多數(shù)的其它細菌受到抑制，然后再進行分離鑒定。（2）熟悉沙門氏菌屬因子血清的使用方法。乙類溶血性鏈球菌在血平板上對桿菌胎敏感，經(jīng)37℃培養(yǎng)18小時，出現(xiàn)明顯抑菌圈。液體培養(yǎng)基中易呈長鏈，固體培養(yǎng)基中常呈短鏈。4．7 桿菌肽敏感試驗挑取乙型溶血性鏈球菌液涂布于血平板上，置于36177。1℃水浴中10min，血漿混合物自行凝固 (凝固程度至試管倒置，內(nèi)容物不流動)。血平板上菌落為灰白色，半透明或不透明，表面光滑有乳光，～，為圓形突起的細小菌落，乙型溶血鏈球菌周圍有2～4mm界限分明、無色透明的溶血圈。1℃培養(yǎng)24h，挑取乙型溶血圓形突起的細小菌落在血平板上分純，然后觀察溶血情況及革蘭氏染色，并進行鏈激酶試驗及桿菌肽敏感試驗。１℃24h血干板（分純培養(yǎng)）36177。3 實驗材料3．1設(shè)備和材料 溫箱、水浴、顯微鏡、離心機、試管架、滅菌平皿、滅菌小試管、載玻片、滅菌吸管（1mL、10mL）滅菌鑷子、均質(zhì)器、酒精燈、接種環(huán)。（2）觀察溶血性鏈球菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)以及在血平板上菌落特征及溶血情況。（3）致病性葡萄球菌血漿凝固酶為陽性。5 實驗結(jié)果（1）金黃色葡萄球菌涂片染色鏡檢為陽性球菌，致病性葡萄球菌一般較非致病性葡萄球菌小，且各個菌體的大小排列也較整齊。1℃溫箱培養(yǎng)。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明圈。1℃培養(yǎng)24h，挑取可疑金黃色葡萄球菌菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。3．2 培養(yǎng)基及試劑 胰酪胨大豆肉湯、%氯化鈉肉湯、豆粉瓊脂、血瓊脂平板、BairdParker瓊脂平板、肉浸液肉湯、兔血漿、革蘭氏染色液等。在BairdParker氏平板上生長時，因?qū)嗧谒徕涍€原成碲酸鉀使菌落呈灰黑色；因產(chǎn)生脂酶使菌落周圍有一渾濁帶，而在其外層因產(chǎn)生蛋白水解酶有一透明帶。（2）觀察金黃色葡萄球菌的革蘭氏染色鏡檢形態(tài)以及在血平板和BairdParker氏瓊脂平板上生長的菌落特征。如由軍事醫(yī)學科學研究院研制而成的一小時快速檢測法，檢驗結(jié)果與國標法一致。本菌在糞便中數(shù)量多，易于培養(yǎng)，對外界的抵抗力與腸道致病菌比較相近，所以選擇大腸埃希氏菌作為被糞便污染的指示菌，合理、科學。研究表明，典型大腸菌隨糞便排到外界環(huán)境中約一周后，典型菌可變?yōu)榉堑湫途?yīng)做進一步觀察，因為這種情況陽性檢出率可達50%以上。凡初發(fā)酵的產(chǎn)氣管一定要做伊紅美蘭平板分離。檢樣稀釋乳糖膽鹽發(fā)酵管(36+1℃,24+2h)不產(chǎn)氣大腸菌群陰性報 告產(chǎn) 氣伊紅美蘭瓊脂平板(36+1℃,24+2h) ↓ (24+2h,36+1℃)革蘭氏染色乳糖發(fā)酵管(36+1℃,24+2h)革蘭氏染色陽性革蘭氏陰性無芽胞桿菌產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸菌群陰性報 告大腸桿菌陽性報 告大腸菌群陰性報 告圖291 大腸菌群檢驗程序5 實驗結(jié)果（1）將大腸菌群檢驗結(jié)果填入下表接種量管號發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果有無典型菌落革蘭氏染色結(jié)果復(fù)發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果最后結(jié)論+或1mL123123123（2）根據(jù)證實為大腸菌群的陽性管數(shù)，查（MPN檢索表后報告每100mL (g)大腸菌群的最可能數(shù)。4．4 分離培養(yǎng)用接種環(huán)挑取產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管劃線接種在伊紅美蘭瓊脂平板上，36+1℃溫箱內(nèi)18～24h培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實試驗。3．3 培養(yǎng)基 乳糖膽鹽培養(yǎng)基，伊紅美蘭瓊脂，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，革蘭氏染色液，%生理鹽水。大腸菌群的檢測就是根據(jù)大腸菌群的定義，即利用它們能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特性而設(shè)計的初發(fā)酵實驗；初發(fā)酵陽性管通過伊紅美蘭平板進行分離；復(fù)發(fā)酵對分離菌作證實實驗的三步法。7 思考題（1）什么是菌落總數(shù)，何謂cfu？（2）若平板上菌落數(shù)生長一半較均勻，另一半呈片生長，如何計數(shù)菌落數(shù)？（3）影響雜菌總數(shù)準確性的因素有哪些？實驗2 食品中大腸菌群的測定1 目的要求（1）學習與掌握食品中大腸菌群的測定方法。但根據(jù)國家頒發(fā)的不同食品的規(guī)定，都是根據(jù)用普通營養(yǎng)瓊脂，37℃（水產(chǎn)品30℃）進行需氧培養(yǎng)的結(jié)果來確定的，而且這種測定確具代表性，因而菌落總數(shù)在一般衛(wèi)生學評價中并不要求用不同培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)。(3) 菌落數(shù)的報告菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來表示。C．若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。4．4 平板菌落計數(shù)方法(1) 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30～300個之間的平板作為菌落總數(shù)測定的標準，且一個稀釋度應(yīng)使用兩個平板的平均數(shù)。（3）根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或?qū)吮疚廴厩闆r的估計，選擇2～3個適宜稀釋液，分別在作10倍遞增稀釋同時，吸取該稀釋度的吸管移取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作兩個平皿。3．2 材料 吸管（、1m和10mL）、廣口瓶或三角燒瓶、滅菌平皿、試管、酒精燈、試管架、滅菌剪刀、滅菌鑷子。由于菌落總數(shù)的測定是在37℃有氧條件下培養(yǎng)的結(jié)果，對于厭氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜熱菌在此條件下不生長，有特殊營養(yǎng)要求的細菌也受到限制。通常以cfu/g（mL，cm2)表示，cfu代表的colony forning unit。食品微生物學實驗技術(shù)實驗1 食品中細菌菌落總數(shù)的測定1 目的要求（1）掌握食品中菌落總數(shù)測定方法。菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)成分，培養(yǎng)溫度和時間、pH、需氧性質(zhì)等），所得1mL（g，cm2)檢樣中所含菌落總數(shù)。菌落總數(shù)的測定是以每個活細菌能克隆增殖形成一個可見的單獨菌落為基礎(chǔ)的，但是在實踐中除了單個細胞形成菌落外，二個或兩個以上相連的同種細胞也同樣可形成菌落，所以現(xiàn)在均以菌落總數(shù)（而不是活細菌數(shù)）或菌落形成單位數(shù)表達。3 實驗材料3．1 儀器 恒溫箱、冰箱、恒溫水浴鍋、天平、微波爐、均質(zhì)器。（2）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液），振搖試管混合均勻，作成1：100稀釋液，按上述操作順序，作10倍系列稀釋液，每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。48+2h36+1℃檢樣做成幾個適當倍數(shù)的稀釋液選擇2～3個適宜稀釋度，各以1ml量加入滅菌平皿內(nèi)每皿內(nèi)加入適量營養(yǎng)瓊脂菌落計數(shù)結(jié)果圖281 菌落總數(shù)實驗程序4．3 菌落計數(shù) 將培養(yǎng)24h后的平板取出，選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標準，一個稀釋度使用兩個平板，取兩個平板的平均數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（或毫升）樣品所含菌落總數(shù)。B．若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30～300個之間，則視二者之比如何來決定，若其比值小于2，應(yīng)報告其平均數(shù)；若兩者之比大于2，則報告其中較小的數(shù)字。F．若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，其中一部分大于300或小于30時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。（2）理論上講，為了得到實驗食品中所有細菌菌落總數(shù)，應(yīng)將樣品接種到幾種不同的培養(yǎng)基中并培養(yǎng)在不同的條件下，所得到的細菌菌落數(shù)總和。由于測試片中含有一種紅色指示劑，使所有菌落易于識別計數(shù)，該片也可用于乳酸菌測定，48hr可確定菌落總數(shù)。它包括大腸埃希氏桿菌和檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌等類大腸桿菌。3．2 材料 吸管（、1mL和10mL）、廣口瓶或三角燒瓶、玻璃珠、平皿、試管、酒精燈、試管架、滅菌剪刀、鑷子、小倒管等。如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色陰性的無芽孢桿菌即可報告為大腸菌群陽性。（1）初發(fā)酵實驗與證實實驗有時不一定符合。（2）關(guān)于產(chǎn)氣 發(fā)酵管內(nèi)的小倒管如儲留氣體則是陽性結(jié)果，如果不存留氣體，但液面及管壁可以看到緩慢上浮的小氣泡，或者對沒有氣體產(chǎn)生的發(fā)酵管用手輕輕彈動試管，有氣泡出現(xiàn)而且沿管壁上升，都應(yīng)考慮可能是由菌發(fā)酵產(chǎn)生氣體的緣故。所以如查出多量典型大腸埃希氏菌表明樣品是糞便的近期污染結(jié)果。大腸埃希氏菌大量存在于人畜腸道，并隨糞便排出。（4）大腸菌群檢驗方法（國標）采用的管發(fā)酵通常需三天，目前已開發(fā)出幾種快速檢驗方法（TTC顯色法，DC試管法，紙片法）。（2）固體檢樣三個稀釋度檢測結(jié)果都是陰性時，MPN怎樣表示？（3）液體檢樣三個稀釋度檢測結(jié)果都是陰性時，MPN怎樣表示？（4）大腸菌群檢驗中為什么首先要用乳糖膽鹽發(fā)酵管發(fā)酵？實驗3 食品中金黃色葡萄球菌的檢測1 目的要求（1）了解食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌的檢測方法。在血平板上生長時，因產(chǎn)生金黃色色素使菌落呈金黃色；由于產(chǎn)生溶血素使菌落周圍形成大而透明的溶血圈。3 實驗材料3．1儀器和材料 顯微鏡、溫箱、離心機、滅菌吸管（1mL，10mL）、滅菌試管、滅菌平皿、均質(zhì)器、載玻片、L型涂布棒、酒精燈、接種環(huán)。1℃溫箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)種于血平板和Baird－Parker平板上，36177。在Baird－Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為2～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。1℃溫箱或水浴內(nèi)，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時呈現(xiàn)凝塊者，被認為陽性結(jié)果。1℃溫箱1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36177。（3）將三個平板中疑似金黃色葡萄球菌的黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。（2）金黃色葡萄球菌在血