【正文】 geic distance. CMCC(F)98003與黑曲霉 A. niger 序列同源性為 100%。1: ITS rDNA PCR amplification result 。 w: Weak growth。 +: 生長旺盛 。 C, 7 d 注 : A菌落形態(tài) 。 C 10 min, 4176。 C 1 min, 55176。 無菌超純水補足總體積 100 μL。 DNA模板 1 μL 。 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2022, Vol. 14 (10): 214 四、微生物鑒定 鑒定實例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ?各種標準中仍將繼續(xù)采用 ATCC 16404作為質(zhì)控菌株 。 th, et al. Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with worldwide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2022, 57: 1925–1932 圖 : RepPCR條碼系統(tǒng)發(fā)育樹 (DiversiLab平臺 ) Figure 2: Dendrogram of RepPCR Barcoding (DiversiLab Platform) . 注：圖片來源于 Reclassification of ATCC174。nos Varga, Sa180。 BOXPCR 根據(jù) BOX插入因子 (大小為 154 bp, 由保守性不同的 box A(57 bp) 、 box B(43 bp) 和 boxC(50 bp)等亞單位組成 )設(shè)計引物 , 擴增微生物基因組 DNA 的重復性片段 , 最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其多態(tài)性 。 培養(yǎng)物 劃線接種于葡萄糖 酵母提取物 蛋白胨固體培養(yǎng)基上， 25℃ 培養(yǎng) 2～ 3 d后 ，取酵母菌制作成水浸片，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 和 無性繁殖方式 等 。 將 培養(yǎng)物 劃線接種于葡萄糖 酵母提取物 蛋白胨固體培養(yǎng)基上， 25℃ 培養(yǎng)2～ 3 d后，進行菌落形態(tài)觀察，菌落質(zhì)地 、 菌落顏色 、 菌落表面是否為反光或暗淡 、 菌落是平伏還是隆起 、 菌落邊緣 等 。 ? 堿性瓊脂： 用于從糞便中分離霍亂弧菌及其它弧菌。 ? 營養(yǎng)肉湯： 用于標本及各類細菌的增菌 ? 巧克力血平板： 其中含有 V和 X因子，適于接種疑有 嗜血桿菌、奈瑟菌 等的標本。 ? 較大的微生物 ，可采用毛細管提取單個個體。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 稀釋搖管法 ? 適合厭氧菌的純培養(yǎng)分離 無菌瓊脂培養(yǎng)基試管加熱 使瓊脂熔化后冷卻并保持在 50℃ 左右 梯度稀釋后的待分離菌株加入試管中 搖勻、冷凝 在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌 液體石蠟和固體石蠟的混合物 培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液體培養(yǎng)基分離 ?不能在固體培養(yǎng)基上生長的微生物 仍需要用液體培養(yǎng)基分離來獲得純培養(yǎng)。 角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 三、微生物分離 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 微生物純培養(yǎng)分離技術(shù) ? 純培養(yǎng)物 是指來源于同一單細胞的細胞群體。 ? 接種工具 ? 微生物接種技術(shù)分類 ? 斜面接種 ? 液體接種 ? 穿刺接種 ? 平板接種 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 斜面接種 ? 左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平； ? 右手先將棉塞（硅膠塞）擰轉(zhuǎn)松動，再拿接種環(huán)； ? 用右手的小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，同時將管口在火焰上灼燒； ? 接種環(huán)灼燒滅菌后插入試管內(nèi)，冷卻、挑菌，轉(zhuǎn)入另一斜面底部，沿斜面劃曲線或直線。微生物基本操作技術(shù) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 CICC 姚 粟 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 內(nèi) 容 ? 微生物分類 ? 微生物接種和培養(yǎng) ? 微生物的分離 ? 微生物的鑒定 ? 微生物保藏 ? 質(zhì)控微生物 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 一、微生物分類 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 一、微生物分類 微生物的進化和多樣性 普遍性系統(tǒng)發(fā)育樹 ,親緣關(guān)系根據(jù) rRNA序列比較來決定。 ? 分類等級 ?界（ Domain） ?門（ Phylum） ?綱（ Class） ?目（ Order） ?科（ Family） ?屬（ Genus） ?種（ Species） 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 微生物接種定義 將微生物的純種或含菌材料（如水、食品、空氣、土壤、排泄物等）轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上，這個操作過程叫微生物的接種。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 二、微生物接種和培養(yǎng) ? 平板接種 ? 平板接種的目的是觀察菌落形態(tài)、分離純化菌種，以及活菌計數(shù)等； ? 平板接斜面：平板分散的單菌落接于斜面； ? 斜面接平板：點種法、劃線法。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 涂布平板法 樣品需適當稀釋 30300CFU/mL 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 平板劃線法 ?斜線法 ?曲線法 ?方格法 ?放射法 ?四格法 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 平板劃線法 斜線法： 用接種環(huán)以無菌操作挑取菌懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線 34條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿 70176。 培養(yǎng)基表面菌落為圓形，而 培養(yǎng)基內(nèi)部 菌落呈 豆狀或透鏡狀 。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 單細胞（孢子）分離 ? 單細胞（或單孢子）分離法是采取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 選擇培養(yǎng)基特性 ?促生長能力 ?抑制能力 ?指示（鑒別）能力 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 選擇培養(yǎng)基分離 ? 傳統(tǒng) 選擇性培養(yǎng)基 ? 血平板： 適于各類細菌的生長，一般細菌檢驗標本的分離，都應接種此平板。 ? SS瓊脂： 有較強的抑菌力，用于志賀菌和沙門菌的分離。 形態(tài)學觀察 細胞特征 培養(yǎng)特征 生理生化試驗 生長溫度 耐鹽性 碳源利用 發(fā)酵產(chǎn)酸 其他 化學成分分析 呼吸醌 極性脂 脂肪酸 分枝菌酸 氨基酸和糖 其他 基因型分析 核酸序列 分析 功能基因 分析 DNA雜交 指紋圖譜、 菌株分型 其他 系統(tǒng)發(fā)育分析 16S rDNA ITS區(qū) 26S D1/D2區(qū) 其他 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 形態(tài)學觀察 細菌 酵母 絲狀真菌 宏觀 形態(tài)（培養(yǎng)特征） 將培養(yǎng)物劃線或稀釋涂布， 30℃ 培養(yǎng) 16~24小時，選取劃線或稀釋涂布分離得到單菌落，觀察和記錄菌落的形狀、大小、質(zhì)地、邊緣、顏色、光澤、透明度、隆起等 。 微觀 形態(tài)（細胞特征） 將培養(yǎng)物在 30℃ 條件下培養(yǎng) 16~24小時，挑取對數(shù)期的單菌落，涂布于事先滴加少量無菌水的載玻片上，自然干燥，加熱固定，進行革蘭氏染色，將制好的染色涂片在 100X40倍的顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、菌體形狀、排列行狀、菌體大小 等細胞特征。 ? 六類鑒定試驗板，可鑒定 500種細菌 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 四、微生物鑒定 化學成分分析 ? 細胞質(zhì)膜： 呼吸醌 （甲基萘醌和泛醌） ? 細胞質(zhì)膜： 極性脂 ? 細胞質(zhì)膜： 脂肪酸 除放線菌外的細菌 ? 外膜： 分枝菌酸 ? 細胞壁： 肽聚糖 （氨基酸和糖） ? 全細胞： 糖和蛋白質(zhì) 放線菌