【正文】 基于 ITS區(qū) rDNA序列的黑色組曲霉的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri. based on Their ITS DNA Sequences 注 : 圖中發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示 Bootstrap值大于 50%數(shù)值 , 圖例為遺傳距離 . Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, geic distance. CMCC(F)98003與與 A. niger ATCC 16888聚類在分類距離最近的一個(gè)分支上 , 序列相似性達(dá) 100% 。 ? 結(jié)合形態(tài)學(xué)、碳源利用情況和 ITS rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析等多相鑒定的結(jié)果 , 將 CMCC(F)98003鑒定為黑曲霉 （ Aspergillus niger ）。 《 中國(guó)微生物菌種保藏管理?xiàng)l例 》 五、微生物保藏 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 制訂專門菌種保藏管理制度； ? 同一株菌種采用兩種以上保藏方法保存； ? 對(duì)只能采用一種保藏方法的菌株備份存放于兩個(gè)以上的保藏設(shè)備中； ? 對(duì)菌種的入庫(kù)和出庫(kù)記錄入檔，實(shí)行雙人負(fù)責(zé)制管理； ? 設(shè)專人負(fù)責(zé)管理菌種保藏設(shè)施正常運(yùn)行，定期檢修維護(hù)。 ? 操作步驟： 斜面制備 接種 培養(yǎng) 保藏 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 斜面制備 培養(yǎng)基配制 分 裝 滅 菌 擺放斜面 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 接 種 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 培養(yǎng) ? 細(xì)菌 37 ℃ ， 12d ? 酵母 28~30℃ ， 2~3d ? 絲狀真菌 26 ℃ ， 5~7d ? 保藏 ? 4~6℃ ? 保藏 3~6個(gè)月 ? 培養(yǎng)和保藏 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 定期移植法 ? 操作簡(jiǎn)單，使用方便； ? 對(duì)設(shè)備和人員要求不高； ? 可隨時(shí)使用，便于觀察菌種； ? 工作勞動(dòng)強(qiáng)度大，屬短期保藏，保藏成本高； ? 菌種傳代頻繁，易退化、污染。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液體石蠟法 ? 操作簡(jiǎn)單，使用比較方便； ? 對(duì)設(shè)備要求不高，對(duì)人員操作水平有一定要求； ? 棉塞 ? 打棉塞， 160℃ 定型 2h； ? 標(biāo)簽 ? 激光打印標(biāo)簽，標(biāo)明菌株編號(hào)和保藏日期，大小約 10 20mm。 ? 用長(zhǎng)毛細(xì)滴管將菌懸液分裝到安瓿管內(nèi)， ～ ，操作時(shí)要把帶有菌懸液的長(zhǎng)毛細(xì)滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 真空度檢測(cè) 用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內(nèi)呈現(xiàn)灰藍(lán) 光，說明真空度符合要求。 準(zhǔn)備冷凍管 準(zhǔn)備保護(hù)劑 （ 10%15%甘油） 準(zhǔn)備菌懸液（細(xì)胞、孢子或芽孢懸液） 制備冷凍管（取菌懸液和保護(hù)劑至冷凍管） 保藏（ 80℃ ， 2～ 5年） 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 Microbank 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 80℃ 冰箱凍結(jié)法 ? 使用方便； ? 保藏時(shí)間較長(zhǎng)； ? 對(duì)設(shè)備要求高 (80℃ 冰箱 )； ? 運(yùn)輸不方便。 同“－ 80℃ 冰箱凍結(jié)法” 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 液氮超低溫凍結(jié)法 ? 保藏時(shí)間長(zhǎng)； ? 保藏效果好，菌種不易退化； ? 對(duì)設(shè)備要求高 (程控降溫儀、液氮罐 )，對(duì)人員操作水平要求高； ? 保藏成本高。 China39。 92 2022版中國(guó)藥典 《 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則 》 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 國(guó)內(nèi)認(rèn)可的菌種收藏機(jī)構(gòu) ? 1979年 7月，全國(guó)第一屆菌種保藏管理會(huì)議正式成立中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)（ CCCCM），委員會(huì)下設(shè) 7個(gè)全國(guó)性菌種保藏管理中心及機(jī)構(gòu)所在地： ? 普通微生物菌種保藏管理中心（ CCGMC） , 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 ? 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ ACCC） ,中國(guó)農(nóng)科院區(qū)劃所 ? 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CICC），中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 ? 醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（ CMCC），中國(guó)藥品生物制品鑒定所 ? 抗菌素菌種保藏管理中心（ CACC），中國(guó)醫(yī)科院醫(yī)用生物技術(shù)研究所 ? 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（ CVCC），農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ? 林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CFCC），中國(guó)林業(yè)科學(xué)院 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 國(guó)認(rèn)外可的菌種收藏機(jī)構(gòu) ? 世界菌種保藏聯(lián)合會(huì) WFCC (World Federation Of Culture Collection)全球注冊(cè)的菌種保藏機(jī)構(gòu) 583家 ? ATCC ? NRRL ? DSMZ ? NCTC ? CMI ? CBS ? NBRC(IFO) ? JCM 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 菌株代數(shù) 美國(guó)藥典（ USP）中規(guī)定： “ 將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上 /內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代， ” 并規(guī)定 “ 菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過 5代 ” 。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 操作步驟 ? 冷凍管準(zhǔn)備 ? 保護(hù)劑制備 ? 保藏培養(yǎng)物準(zhǔn)備 ? 預(yù)凍 — 將程序降溫系統(tǒng)預(yù)冷到 4℃ ，將制備好的冷凍管放入其中，以 1℃ /min降溫速率降至 35℃ ； — 使用程序降溫盒。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 真空冷凍干燥法 ? 保藏、運(yùn)輸方便； ? 保藏時(shí)間長(zhǎng) (5 ～ 10年 )； ? 對(duì)設(shè)備要求高 (真空冷凍干燥機(jī)、多歧管 )，對(duì)人員操作水平要求高； ? 冷凍干燥過程對(duì)菌體有損傷，需恢復(fù)培養(yǎng)。 ? 終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷 ： ? 安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀 ? 真空度接近空載時(shí)的最高值 ? 樣品溫度與管外溫度接近 ? 選用 1～ 2支對(duì)照管 ， 其水份與菌懸液同量 ， 當(dāng)其水分完全蒸發(fā)時(shí)視為干燥完結(jié) 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 預(yù)凍 ? 制備菌懸液、經(jīng)分裝到進(jìn)行預(yù)凍之間的時(shí)間不宜超過 1h； ? 分裝完成后將安瓿管立刻放入－ 35～－ 40℃ 冰箱預(yù)凍 1h，使菌液完全凍結(jié)； ? 可采用分段式預(yù)凍，先將分裝好的安瓿管置－ 20℃ 凍 30分鐘，再放入－ 80℃ 冰箱凍 30min； ? 采用離心式凍干裝置時(shí)勿需預(yù)凍。 ? 滅菌 ? 121 ℃ ， 30min. 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 保護(hù)劑的準(zhǔn)備 ? 保護(hù)劑： 12%脫脂牛奶蒸餾水溶液， 2～ 5ml/管； ? 滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中， 113℃ 滅菌20min； ? 打開放氣閥緩慢排出蒸汽， 取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻； ? 30℃ 培養(yǎng) 2天，無菌檢查合格后備用。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 真空冷凍干燥法 ? 指將保藏的菌種細(xì)胞或孢子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長(zhǎng)期菌種保存方法。 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ? 操作步驟： 液體石蠟預(yù)處理 斜面培養(yǎng)物制備 灌 注 石 蠟 保 藏 ?優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟 ?滅菌： — 121℃ 濕熱滅菌 30min，蒸發(fā)水分； — 160 ℃ 干熱滅菌 2h； ?冷卻至室溫。 ?基本措施 是低溫、真空、干燥 。 ? 菌種保藏管理 要求各保藏中心必須具有保藏菌種的詳細(xì)歷史及有關(guān)實(shí)驗(yàn) 資料 。 四、微生物鑒定 鑒定實(shí)例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗(yàn)員操作實(shí)務(wù)與潔凈室管理，北京， 2022 ?β微管蛋白基因序列 分析 圖 基于 β微管蛋白基因序列的黑色組曲霉的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig Neighbourjoining tree based on βtubulin sequence data of Aspergillus section Nigri 注 : 圖中發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示 Bootstrap 值大于 50%數(shù)值 , 圖例為遺傳距離 . Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar,