【正文】 基于 ITS區(qū) rDNA序列的黑色組曲霉的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri. based on Their ITS DNA Sequences 注 : 圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示 Bootstrap值大于 50%數值 , 圖例為遺傳距離 . Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, geic distance. CMCC(F)98003與與 A. niger ATCC 16888聚類在分類距離最近的一個分支上 , 序列相似性達 100% 。 ? 結合形態(tài)學、碳源利用情況和 ITS rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析等多相鑒定的結果 , 將 CMCC(F)98003鑒定為黑曲霉 （ Aspergillus niger ）。 《 中國微生物菌種保藏管理條例 》 五、微生物保藏 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 制訂專門菌種保藏管理制度； ? 同一株菌種采用兩種以上保藏方法保存； ? 對只能采用一種保藏方法的菌株備份存放于兩個以上的保藏設備中； ? 對菌種的入庫和出庫記錄入檔，實行雙人負責制管理； ? 設專人負責管理菌種保藏設施正常運行，定期檢修維護。 ? 操作步驟： 斜面制備 接種 培養(yǎng) 保藏 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 斜面制備 培養(yǎng)基配制 分 裝 滅 菌 擺放斜面 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 接 種 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 培養(yǎng) ? 細菌 37 ℃ ， 12d ? 酵母 28~30℃ ， 2~3d ? 絲狀真菌 26 ℃ ， 5~7d ? 保藏 ? 4~6℃ ? 保藏 3~6個月 ? 培養(yǎng)和保藏 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 定期移植法 ? 操作簡單，使用方便； ? 對設備和人員要求不高； ? 可隨時使用，便于觀察菌種； ? 工作勞動強度大，屬短期保藏，保藏成本高； ? 菌種傳代頻繁，易退化、污染。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 液體石蠟法 ? 操作簡單，使用比較方便； ? 對設備要求不高，對人員操作水平有一定要求； ? 棉塞 ? 打棉塞， 160℃ 定型 2h； ? 標簽 ? 激光打印標簽，標明菌株編號和保藏日期，大小約 10 20mm。 ? 用長毛細滴管將菌懸液分裝到安瓿管內， ～ ，操作時要把帶有菌懸液的長毛細滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 真空度檢測 用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內呈現灰藍 光，說明真空度符合要求。 準備冷凍管 準備保護劑 （ 10%15%甘油） 準備菌懸液（細胞、孢子或芽孢懸液） 制備冷凍管（取菌懸液和保護劑至冷凍管） 保藏（ 80℃ ， 2～ 5年） 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 Microbank 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 80℃ 冰箱凍結法 ? 使用方便； ? 保藏時間較長； ? 對設備要求高 (80℃ 冰箱 )； ? 運輸不方便。 同“－ 80℃ 冰箱凍結法” 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 液氮超低溫凍結法 ? 保藏時間長； ? 保藏效果好，菌種不易退化； ? 對設備要求高 (程控降溫儀、液氮罐 )，對人員操作水平要求高； ? 保藏成本高。 China39。 92 2022版中國藥典 《 藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則 》 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 國內認可的菌種收藏機構 ? 1979年 7月，全國第一屆菌種保藏管理會議正式成立中國菌種保藏管理委員會（ CCCCM），委員會下設 7個全國性菌種保藏管理中心及機構所在地： ? 普通微生物菌種保藏管理中心（ CCGMC） , 中國科學院微生物研究所 ? 農業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ ACCC） ,中國農科院區(qū)劃所 ? 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CICC），中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 ? 醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（ CMCC），中國藥品生物制品鑒定所 ? 抗菌素菌種保藏管理中心（ CACC），中國醫(yī)科院醫(yī)用生物技術研究所 ? 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（ CVCC），農業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ? 林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ CFCC），中國林業(yè)科學院 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 國認外可的菌種收藏機構 ? 世界菌種保藏聯(lián)合會 WFCC (World Federation Of Culture Collection)全球注冊的菌種保藏機構 583家 ? ATCC ? NRRL ? DSMZ ? NCTC ? CMI ? CBS ? NBRC(IFO) ? JCM 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 菌株代數 美國藥典（ USP）中規(guī)定： “ 將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上 /內，每萌發(fā)一次即稱為一代， ” 并規(guī)定 “ 菌種的傳代次數（自原始菌種凍干粉起）不得超過 5代 ” 。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 操作步驟 ? 冷凍管準備 ? 保護劑制備 ? 保藏培養(yǎng)物準備 ? 預凍 — 將程序降溫系統(tǒng)預冷到 4℃ ，將制備好的冷凍管放入其中，以 1℃ /min降溫速率降至 35℃ ； — 使用程序降溫盒。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 真空冷凍干燥法 ? 保藏、運輸方便； ? 保藏時間長 (5 ～ 10年 )； ? 對設備要求高 (真空冷凍干燥機、多歧管 )，對人員操作水平要求高； ? 冷凍干燥過程對菌體有損傷，需恢復培養(yǎng)。 ? 終止干燥時間應根據下列情況判斷 ： ? 安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀 ? 真空度接近空載時的最高值 ? 樣品溫度與管外溫度接近 ? 選用 1～ 2支對照管 ， 其水份與菌懸液同量 ， 當其水分完全蒸發(fā)時視為干燥完結 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 預凍 ? 制備菌懸液、經分裝到進行預凍之間的時間不宜超過 1h； ? 分裝完成后將安瓿管立刻放入－ 35～－ 40℃ 冰箱預凍 1h，使菌液完全凍結； ? 可采用分段式預凍，先將分裝好的安瓿管置－ 20℃ 凍 30分鐘，再放入－ 80℃ 冰箱凍 30min； ? 采用離心式凍干裝置時勿需預凍。 ? 滅菌 ? 121 ℃ ， 30min. 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 保護劑的準備 ? 保護劑： 12%脫脂牛奶蒸餾水溶液， 2～ 5ml/管； ? 滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中， 113℃ 滅菌20min； ? 打開放氣閥緩慢排出蒸汽， 取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻； ? 30℃ 培養(yǎng) 2天，無菌檢查合格后備用。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 真空冷凍干燥法 ? 指將保藏的菌種細胞或孢子懸浮于保護劑中，經預凍后在真空條件下使水分升華，再經真空封存后保存的一種長期菌種保存方法。 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ? 操作步驟： 液體石蠟預處理 斜面培養(yǎng)物制備 灌 注 石 蠟 保 藏 ?優(yōu)質化學純液體石蠟 ?滅菌： — 121℃ 濕熱滅菌 30min，蒸發(fā)水分； — 160 ℃ 干熱滅菌 2h； ?冷卻至室溫。 ?基本措施 是低溫、真空、干燥 。 ? 菌種保藏管理 要求各保藏中心必須具有保藏菌種的詳細歷史及有關實驗 資料 。 四、微生物鑒定 鑒定實例 2 醫(yī)療器械無菌檢驗員操作實務與潔凈室管理，北京， 2022 ?β微管蛋白基因序列 分析 圖 基于 β微管蛋白基因序列的黑色組曲霉的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig Neighbourjoining tree based on βtubulin sequence data of Aspergillus section Nigri 注 : 圖中發(fā)育樹節(jié)點只顯示 Bootstrap 值大于 50%數值 , 圖例為遺傳距離 . Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar,