【正文】 單孢子懸液 誘變處理 挑取單菌落 200個 搖瓶 初篩 50株 挑出高產(chǎn)斜面 留種保 藏菌種 傳種斜面 搖瓶 復(fù)篩 5株 挑出高產(chǎn)菌株 放大 罐 試驗 ， 中試考查 大型投產(chǎn)試驗 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 62 誘變篩選 過 程 中的 致死率 、 突變率 、 正變率 、 高產(chǎn)率 、 投產(chǎn)率 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 63 （ 四 ） 篩選的方法 ? 隨機篩選 也稱搖瓶篩選 ， 具體做法是：將誘變處理后菌體分離到瓊脂平板上 ， 培養(yǎng)后 隨機挑選菌落 ， 一個菌落移入一支斜面 ，然后一支斜面的菌體接入一個三角瓶 ， 放置在搖床上振蕩培養(yǎng) ， 根據(jù)所測定產(chǎn)物活性的高低 ， 決定取舍 。 通過平板菌落預(yù)篩主要是淘汰那些低產(chǎn)菌株 ， 有的是根據(jù) 菌落形態(tài) 來淘汰 ， 如紅霉素產(chǎn)生菌 ， 若突變株是帶色素的 ， 往往是低產(chǎn)株應(yīng)淘汰；有的是根據(jù) 生化反應(yīng)特征 來淘汰 ， 如抑菌圈 、變色圈 、 透明圈或其他特異性反應(yīng)圈 。然后稀釋涂平板，培養(yǎng)后挑單菌落進行選擇。 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 69 ? 神舟七號飛船搭載微生物菌種包括 靈芝 、 平菇 、 蟲草 、 雙孢蘑菇 、 杏鮑菇 、 茶樹菇 6種19管 ? 中國南方航天育種技術(shù)研究中心和江西省農(nóng)科院微生物研究所共同合作，采用航天育種誘變技術(shù)培育出的金針菇 “ 航金１號 ” 和“ 航金２號 ” ，日前通過專家鑒定。 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 68 航天育種 所謂航天育種是利用空間環(huán)境 高真空 、 微重力 和 強輻射 的特點，在宇宙射線的輻射作用下，使生物的遺傳性狀發(fā)生變異，從而選育出優(yōu)良品種。 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 65 （五）幾種誘變劑的使用方法 新鮮斜面菌種 +生理鹽水或緩沖液洗下 → 振蕩 →稀釋菌懸液 → 取 5ml菌懸液 → 無菌培養(yǎng)皿 → 磁力攪拌→ 15W、 30cm紫外燈（營養(yǎng)體 3~5min，芽孢 10min）照射 → 黑紙包好增殖培養(yǎng) → 挑單菌落 化學(xué)誘變（以亞硝酸為例） 亞硝酸易分解，故常在誘變前用亞硝酸鈉在 的醋酸緩沖液中生成亞硝酸的方法現(xiàn)配現(xiàn)用。 ? 先平板菌落預(yù)篩 ， 再搖瓶振蕩培養(yǎng)復(fù)篩 大量菌落先經(jīng)過平板預(yù)篩 ， 保留 5%~10%的預(yù)篩菌株 （ 約200株 ） ， 再進行搖瓶培養(yǎng) ， 復(fù)證被篩菌株的重演性 ， 同時從200株中篩選出更高產(chǎn)量的突變株 。 （ 3） 振蕩培養(yǎng)處理 ：即在搖瓶培養(yǎng)基中加入一定量的誘變劑 。 致死率 90%~ %（ 過去 ） 70%~80%（ 現(xiàn)在 ） 。 誘變劑作用細胞后 ， 對 DNA作用引起突變 ， 但不一定都能形成突變體 ， 原因是 菌體為了生存 ， 具有一套自我修復(fù)系統(tǒng) 。 ★ 對 菌株產(chǎn)量，形態(tài)、生理等情況了解； ★ 生長繁殖快，營養(yǎng)要求低，產(chǎn)孢子多且早； ★ 對誘變劑敏感； ★ 菌株要有一定的生產(chǎn)能力； ★ 多出發(fā)菌株：一般采用 3~4個出發(fā)菌株，在逐代處理后， 將產(chǎn)量高、特性好的菌株留作繼續(xù)誘變的出發(fā)菌株。 化學(xué)誘變劑使用過程的安全性 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 55 ? NTG(亞硝基胍） 是一種強烈致癌物質(zhì)，操作時要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進行。 誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑 誘變劑 表 21 物理的：紫外線 、 快中子 、 x射線等 化學(xué)的：硫酸二乙酯 、 亞硝基胍 、 Y啶類物質(zhì)等 { 生物的：噬菌體 、 轉(zhuǎn)座子 誘變育種的理論基礎(chǔ)是： 基因突變 ？ ● 紫外線使用時間較久，輻射光源便宜，危險性小，誘變效果好應(yīng)用最廣泛，研究最多。 ? 傳代穩(wěn)定性試驗。復(fù)篩條件已較接近發(fā)酵生產(chǎn)工藝。用于特征明顯的微生物如絲狀真菌、放線菌及部分細菌。 回復(fù)突變： 高產(chǎn)菌株在傳代的過程中 ， 由于自然突變導(dǎo)致高產(chǎn)性狀的丟失 ， 生產(chǎn)性能下降 ， 這種情況我們稱為回復(fù)突變 。 ? 互變異構(gòu)效應(yīng) ：指四種堿基第六位上的酮基或氨基的瞬間變構(gòu)，會引起堿基的錯配。 另一種是我們生產(chǎn)上希望看到的 ， 對生產(chǎn)有利 ， 這種突變成為 正突變 。 返回 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 40 167。 傳統(tǒng)上常用 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌 作為工具菌檢驗抗生素的抗性，現(xiàn)采用聯(lián)合工具菌如 枯草芽孢桿菌和綠色產(chǎn)色鏈霉菌或巴氏梭狀芽孢桿菌 ，可分離出抗菌活性低，對其它試驗菌活性高的新抗生素，如黃色霉素族的抗生素，而這些抗生素在單獨使用枯草芽孢桿菌作工具菌時無法檢出。 變色圈法： 對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 31 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 32 A 分區(qū) 劃線法 B 連續(xù)劃線法 返回 長江大學(xué)生科院生物工程系 33 將 樣 品 分 散到最低濃度 倒平板 ， 培養(yǎng) ，挑取單菌落 后面 3個稀釋度各取 ml涂布 返回 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 34 返回 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 35 例 1：分離某種 產(chǎn)生有機酸的菌株 時，在培養(yǎng)基中添加碳酸鈣 。 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 30 常規(guī)分離法： 平板 劃線法 、 稀釋分離法 和 涂布法 生化反應(yīng)分離法： 透明圈法 、 變色圈法 、 抑菌圈法 、生長圈法 。 恒化式富集培養(yǎng) ： 通過改變限制性基質(zhì)濃度，來控制兩類不同菌株的比生長速率。 四、目的微生物富集的一些基本方法 ?富集的目的： 讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢，使 篩選變得可能。已記述約10個種。 2022年 9月 20日星期二 長江大學(xué)生科院生物工程系 23 C、微生物的生理特性 篩選 高溫酶產(chǎn)生菌 時，通常到溫度較高的南方，或溫泉、火山爆發(fā)處及北方的堆肥中采集樣品； 低溫酶產(chǎn)生菌 時，南北極地區(qū)、冰窯、深海； 分離 耐壓菌 則從深海底部采樣，如 Micrococcus aquivivus水活微球菌 ,耐 600個大氣壓； 分離 耐高滲透壓酵母菌 時，通常到甜果、蜜餞或甘蔗渣