20xx年醫(yī)學專題—流式細胞術的原理和應用-wenkub
2024-11-15 05 本頁面
【正文】 y242。,Ct值與起始(qǐ shǐ)模板的關系,研究(y225。,Ct值的確定(qu232。ngguāng)閾值（threshold）,第二十四頁，共一百一十五頁。 SDcycle 315 意義：大于熒光背景值和陰性對照熒光最高值，進入(j236。n),第二十二頁，共一百一十五頁。ng c237。ngli224。diǎn)，目前已得到廣泛應用。 分子雜交：檢測產(chǎn)物特異性，分析堿基突變 核酸(h233。)基因特異性引物； 反應混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg++,第十七頁，共一百一十五頁。 jī)引物，Oligo(dT)，基因特異性引物（GSP) 逆轉錄酶：AMV MMLV Quant Reverse Transcriptase,第十六頁，共一百一十五頁。ng)過程,反轉錄(zhuǎn l249。,反轉錄(zhuǎn l249。nx236。nhu225。,第十頁，共一百一十五頁。,第九頁，共一百一十五頁。,1.分子生物學測定法,是測定細胞因子mRNA的表達水平，主要有兩種方法： 分子(fēnzǐ)雜交技術 多聚酶鏈反應技術（PCR）,第八頁，共一百一十五頁。已批準生產(chǎn)：IFNα、β、γ，Epo，GMCSF，GCSF，IL2，正在進行臨床試驗的：IL11，MCSF，SCF，TGFβ等,第六頁，共一百一十五頁。nɡ)應用,第五頁，共一百一十五頁。,第四頁，共一百一十五頁。)細胞功能的常用檢測方法,第二頁，共一百一十五頁。)方法簡介,劉素俠 山東大學(shān dōnɡ d224。 xu233。,一、免疫學檢測(jiǎn c232。,二、細胞因子檢測(jiǎn c232。,（一）細胞因子的臨床意義,細胞因子與疾?。赫Ｇ闆r下，細胞因子表達和分泌受機體的嚴格調(diào)控，在病理狀態(tài)下細胞因子會出現(xiàn)異常性表達，表現(xiàn)(biǎoxi224。,（二）常規(guī)檢測(jiǎn c232。,分子雜交(z225。,多聚酶鏈反應技術(j236。,PCR原理(yu225。n)進行，使目的DNA得以迅速擴增。ng),退火(tu236。)PCR （Reverse transcription PCR，RTPCR),第十三頁，共一百一十五頁。)PCR： mRNAcDNAPCR 抽提RNA 反轉錄合成cDNA PCR 擴增,第十五頁，共一百一十五頁。,PCR反應(fǎny236。,RTPCR反應(fǎny236。 suān)序列分析（測序）：是檢測PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法,第十八頁，共一百一十五頁。,第十九頁，共一百一十五頁。ngfēnxī)的方法。)概念,擴增曲線(qūxi224。,設定(sh232。nr249。,Ct值,Ct值的含義是：擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的域值時所需要的循環(huán)次數(shù)(c236。d236。njiū)表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。nɡ)標記方法,非特異性熒光標記： SYBR Green I 特異性熒光標記： TaqMan Probe； 分子(fēnzǐ)信標,第二十八頁，共一百一十五頁。,第二十九頁，共一百一十五頁。,結果判定(p224。,（3）qPCR結果分析—— 相對(xiāngdu236。,必須用內(nèi)對照(du236。)文獻提供； 通過具體實驗。ngli224。),目的基因定量結果,管家基因定量結果,相對值,待測樣品校正值,對照樣品校正值,=,=,校正值,=,目的基因定量結果,校正值,=,管家基因定量結果,目的基因定量結果,校正值,=,對照樣品校正值,待測樣品校正值,對照樣品校正值,=,待測樣品校正值,對照樣品校正值,第三十九頁，共一百一十五頁。,2） 2 △ △Ct法,第四十二頁，共一百一十五頁。)高； 速度快、高通量； 線性關系好、線性范圍寬,第四十四頁，共一百一十五頁。,（1）依賴性細胞株,一些腫瘤細胞株必須依賴于細胞因子方能在體外增殖，如DTLL細胞株依賴IL2；FDCPL細胞株依賴于小鼠IL3；TF1細胞株依賴于人IL3和人GMCSF，因而可利用這些(zh232。ng)檢測,利用一些細胞因子的功能特性，可建立(ji224。,第四十七頁，共一百一十五頁。,第四十八頁，共一百一十五頁。,第四十九頁，共一百一十五頁。,第五十頁，共一百一十五頁。ngm243。y242。,F. 抗體(k224。)活性測定（試驗四）,第五十四頁，共一百一十五頁。)度,OD值,1/8 1/4 S 1/2 A 1,100%OD,50%OD,標準(biāozhǔn)品,待測品,第五十六頁，共一百一十五頁。ngli224。ngd224。)細胞因子的T細胞（頻率）,第五十九頁，共一百一十五頁。在活化過程中加入蛋白質運輸抑制物，如莫能菌素(monensin)和布雷菲爾德菌素A，阻止了細胞因子分泌，提高了胞內(nèi)檢測的陽性率； 檢測方法：ELISPOT 熒光標記：熒光顯微鏡或FCM,第六十一頁，共一百一十五頁。,第六十二頁，共一百一十五頁。ng)時間后，收集細胞進行表面抗原染色（如CD4或CD8）、固定和通透、細胞內(nèi)細胞因子染色、流式細胞儀測定和結果分析。xīn),(3) 混勻后，緩慢(huǎnm224。,（四）細胞因子檢測(jiǎn c232。)細胞功能檢測方法,評價機體的特異性和非特異性免疫(miǎny236。ng),淋巴細胞的功能檢測 T細胞功能檢測 B細胞功能檢測 NK細胞功能檢測 吞噬細胞功能檢測 免疫細胞功能檢測的臨床(l237。ng)檢測,淋巴細胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗； 體內(nèi)實驗主要是間接了解(liǎojiě)淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應答反應； 體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定,第七十頁，共一百一十五頁。,1. T細胞(x236。,（1）T淋巴細胞增殖(zēngzh237。ng),分化,母細胞,刺激物,細胞變大,細胞漿擴大,空泡,核仁明顯,核染色質疏松,第七十四頁，共一百一十五頁。 zh
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