20xx年醫(yī)學(xué)專題—流式細(xì)胞術(shù)的原理和應(yīng)用-全文預(yù)覽
【正文】 固有免疫,第七十一頁，共一百一十五頁。nɡ)應(yīng)用,第六十九頁，共一百一十五頁。,內(nèi)容(n232。,第六十七頁，共一百一十五頁。,圖1. 表達(dá)IL17和IFN?的CD4+T細(xì)胞(x236。,(1) 抗凝 靜脈血,(2) 加等量(děnɡ li224。)方法,第六十三頁，共一百一十五頁。hu224。,（三）胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)(jiǎn c232。 免疫標(biāo)記技術(shù),第五十八頁，共一百一十五頁。,3. 免疫化學(xué)測(cè)定法,用來檢測(cè)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的抗原特性，利用抗體對(duì)抗原表位的識(shí)別，測(cè)定的是可溶性細(xì)胞因子的抗原性。ngji224。n) 標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值 找出與標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋度(S) 找出與標(biāo)準(zhǔn)品50%最大OD值相對(duì)應(yīng)的待測(cè)品稀釋度(A) 待測(cè)品單位數(shù)=S/A標(biāo)準(zhǔn)品單位,第五十五頁，共一百一十五頁。,第五十三頁，共一百一十五頁。ngzhī)趨化法，PMN或淋巴細(xì)胞作為指示細(xì)胞，以細(xì)胞趨化的程度來反映樣品中IL8活性水平。,第五十一頁，共一百一十五頁。oy236。jiē)殺傷靶細(xì)胞,細(xì)胞因子TNFα、TNFβ具有直接殺傷某些腫瘤細(xì)胞的作用，采用TNF敏感的細(xì)胞株如小鼠成纖維細(xì)胞株L929，以WEHI164亞克隆13（鼠纖維肉瘤細(xì)胞系）作為指示細(xì)胞，通過(tōnggu242。ngch233。)或增殖(zēngzh237。)相應(yīng)的活性測(cè)定方法，如干擾素的抑制病毒感染效應(yīng)，腫瘤壞死因子對(duì)L929細(xì)胞的殺傷作用等。,第四十六頁，共一百一十五頁。)活性檢測(cè)法,測(cè)定細(xì)胞因子的生物學(xué)活性：刺激細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞生長(zhǎng)(shēngzhǎng)和存活、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(shēngzhǎng)、溶解或殺滅細(xì)胞、抗病毒、促進(jìn)細(xì)胞趨化、刺激細(xì)胞生成集落等活性； 指示細(xì)胞：多選用造血系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)細(xì)胞，最好用依賴性細(xì)胞株細(xì)胞； 顯示細(xì)胞反應(yīng)：用3H胸腺嘧啶核苷參入，或用四唑鹽轉(zhuǎn)化引致的顏色反應(yīng)。,優(yōu)點(diǎn)(yōudiǎn),特異性好； 簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度(ch233。,優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn)：分析簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化相對(duì)簡(jiǎn)單； 缺點(diǎn)：對(duì)每一個(gè)(yī ɡ232。 公式：,校正值(zh232。,3）分析方法,雙標(biāo)準(zhǔn)(biāozhǔn)曲線法 2 △ △Ct法（Ct值比較法）,第三十八頁，共一百一十五頁。o)基因（管家基因）進(jìn)行校正,第三十六頁，共一百一十五頁。,1）相對(duì)(xiāngdu236。ng)——融解曲線,第三十二頁，共一百一十五頁。o)法原理,第三十頁，共一百一十五頁。o)法,SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域(qūy249。,（2）常用(ch225。ngpǐn) Ct值=17（第17個(gè)循環(huán)時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到域值）,第二十六頁，共一百一十五頁。) C代表Cycle（循環(huán)數(shù)） t代表threshold （熒光域值）,第二十五頁，共一百一十五頁。,熒光(y237。nɡ)熒光域值,PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)； 熒光域值的設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，即：threshold = 10 180。,擴(kuò)增曲線(qūxi224。,1) 常用名詞(m237。nlǐ),實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析(d236。ngguāng)定量PCR (Fluorescence Quantified real time PCR),與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)(t232。 酶切分析：對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行鑒定、對(duì)靶基因分型及進(jìn)行變異性研究。d236。ng)體系,模板：總RNA，mRNA 引物：隨機(jī)(su237。,RTPCR反應(yīng)(fǎny236。nshēn),第二循環(huán),dsDNA,ssDNA,加入引物,5’,3’,3’,5’,dNTP, Taq酶,5’,3’,5’,5’,3’,3’,3’,5’,5’,3’,5’,5’,第十二頁，共一百一十五頁。,5’,3’,5’,3’,變性(bi224。由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)(x)（PCR）,PCR（polymerase chain reaction)技術(shù)，是一種高效的基因體外擴(kuò)增技術(shù)； 將細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的RNA提取出來，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，在細(xì)胞因子引物的引導(dǎo)下，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 優(yōu)點(diǎn)(yōudiǎn)：靈敏度高 操作簡(jiǎn)便 缺點(diǎn)：測(cè)定結(jié)果只能代表細(xì)胞因子基因的表達(dá)，而不能代表活性細(xì)胞因子的水平。)，而不能代表活性細(xì)胞因子的水平。)活性檢測(cè)法 免疫化學(xué)測(cè)定法,第七頁，共一百一十五頁。 細(xì)胞因子與治療：重組細(xì)胞因子做為生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。n chu225。ng)的特異性是各種免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的基本原理,第三頁，共一百一十五頁。,內(nèi) 容,細(xì)胞因子檢測(cè)的常用方法 免疫(miǎny236。細(xì)胞因子及免疫細(xì)胞功能檢測(cè)(jiǎn c232。)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所 2011223,第一頁，共一百一十五頁。)的基本原理,抗原與抗體反應(yīng)(fǎny236。)方法,細(xì)胞因子的臨床意義 常規(guī)測(cè)定法 胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)方法 細(xì)胞因子檢測(cè)的主要臨床(l237。n)為細(xì)胞因子及其受體的缺陷，細(xì)胞因子表達(dá)過高，以及可溶性細(xì)胞因子受體的水平增加等。)方法,分子生物學(xué)測(cè)定法 生物(shēngw249。jiāo)技術(shù),制備細(xì)胞因子的基因探針； Northern 雜交或細(xì)胞原位雜交； 優(yōu)點(diǎn)：高度敏感和高度特異； 缺點(diǎn)：操作較繁瑣 測(cè)定結(jié)果只能代表細(xì)胞因子基因的表達(dá)(biǎod225。sh249。nlǐ),PCR是體外酶促合成特異DNA片段的方法。 由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： ①模板DNA的變性：dsDNA ssDNA ②退火(復(fù)性)：模板DNA與引物的互補(bǔ)配對(duì) ③延伸：DNA模板與引物按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新DNA 鏈 新鏈又可成為下次循環(huán)的模板,可將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍,第十一頁，共一百一十五頁。 huǒ),延伸(y225。,
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