20xx年醫(yī)學(xué)專題—流式細胞術(shù)的原理和應(yīng)用-預(yù)覽頁
【正文】 RT,PCR,第十四頁，共一百一十五頁。,RT反應(yīng)(fǎny236。ng)體系,模板：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 目的(m249。ng)產(chǎn)物檢測,凝膠電泳分析：初步判斷產(chǎn)物的特異性。,實時熒光(y237。,（1）原理(yu225。,第二十頁，共一百一十五頁。n) 熒光閾值 Ct值,第二十一頁，共一百一十五頁。 d236。)指數(shù)期的最初階段； 真正熒光信號：熒光信號大于閾值,第二十三頁，共一百一十五頁。sh249。ng),橫坐標：PCR循環(huán)數(shù) 縱坐標：熒光信號強 度 黑線：熒光域值 紅線：無模板 域值下一 直線 綠線 ：樣品(y224。 利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,第二十七頁，共一百一十五頁。,SYBR Green I染料(rǎnli224。,SYBR Green I染料(rǎnli224。nd236。)定量解析,第三十四頁，共一百一十五頁。zh224。,第三十七頁，共一百一十五頁。ng)，然后根據(jù)公式計算相對值，即為相對表達量。,第四十頁，共一百一十五頁。,2 △ △Ct法：假設(shè)目的基因、對照基因擴增效率均是100% △Ct（處理前/對照組）=1817=1 △Ct（處理后/實驗組）=1617.4=1.4 △ △ Ct= △Ct（處理后）△Ct（處理前)=2.4 比率(bǐlǜ)（處理后/處理前）= 2 △ △Ct=2 2.4 =5.3 結(jié)論：JUN處理后表達水平是處理前的5.3倍 修正：擴增效率不是1，而是E， 2 △ △Ct可修正為（1+E） △ △Ct,第四十三頁，共一百一十五頁。,2. 生物(shēngw249。xiē)依賴細胞株檢測相應(yīng)的細胞因子； 優(yōu)點：敏感性高，特異性強； 缺點：應(yīng)用有限。nl236。,A. 增殖(zēngzh237。,B. 集落形成(x237。,C. 直接(zh237。,D. 抗病毒效應(yīng)(xi224。)的上皮細胞WISH，通過干擾素（IFNα、IFNβ、IFNγ）抑制病毒致病變的程度，計算出待測樣品中IFN的活性單位。ng),IL8對多形核細胞、淋巴細胞具有趨化作用，可用小室法或軟瓊脂(qi243。ngtǐ)形成法,IL6可在體外刺激某些B淋巴細胞系產(chǎn)生(chǎnshēng)和分泌免疫球蛋白； 指示細胞：分泌IgG的ARH7CESS 分泌IgM的SKW6.CL4 方法：在一定條件下，待檢樣品中IL6水平與培養(yǎng)細胞上清IgG或IgM水平正相關(guān)，通過標準IL6的對照可推算出待檢樣品中IL6的活性。,一般(yībān)方法,細胞因子敏感的細胞株 細胞因子的標準品及待測品 指示劑：MTT，3HTdR 酶聯(lián)免疫吸附測定儀測定OD值 繪制標準曲線(qūxi224。,對生物學(xué)活性測定法的評價(p237。ng) 特異性差 實驗周期較長 易受其它因素的影響,第五十七頁，共一百一十五頁。)和顯示，從而定性或定量顯示細胞因子（或受體）的水平。,60,第六十頁，共一百一十五頁。,活化劑,活化(hu243。,人外周血單個核細胞IL17A流式檢測(jiǎn c232。,第六十四頁，共一百一十五頁。n)加于分離液上,第六十五頁，共一百一十五頁。)的臨床應(yīng)用,機體免疫狀態(tài)的評估； 疾病預(yù)后及治療監(jiān)測指標(zhǐbiāo)； 病理變化和損傷機理研究； 輔助診斷。)功能,第六十八頁，共一百一十五頁。n chu225。,淋巴細胞,T細胞：介導(dǎo)細胞免疫(miǎny236。bāo)功能檢測,體外實驗： T細胞增殖試驗 T細胞分泌功能測定(c232。)試驗,A.原理(yu225。,第七十五頁，共一百一十五頁。,T細胞(x236。,常用(ch225。i)計數(shù)法,同位素摻入法,CCK8法,MTT法,FCM法, 第4次實驗(sh237。ngt224。n)染色,共培養(yǎng),形態(tài)學(xué)觀察 計算轉(zhuǎn)化率,第八十頁，共一百一十五頁。 缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準確性較差。ch233。)/對照管cpm均值,優(yōu)點：敏感性高，客觀性強，重復(fù)性好。)的淋巴細胞,PHA,共培養(yǎng),DNA合成(h233。,MTT法 CFSE染色檢測(jiǎn c232。ng)T細胞功能。bāo)毒實驗,T細胞介導(dǎo)的細胞毒性是致敏的T細胞再次遇相應(yīng)靶細胞抗原，可表現(xiàn)出對靶細胞的破壞和溶解作用。,A.原理(yu225。bāo),觀察殺傷活力,致敏CTL,靶細胞,第八十九頁，共一百一十五頁。,第九十一頁，共一百一十五頁。n)皮膚試驗 PHA皮膚試驗,第九十二頁，共一百一十五頁。,(1) B細胞(x236。,（2）體外抗體(k224。,溶血(r243。 分為直接溶血空斑試驗和間接溶血空斑試驗 ； 直接溶血空斑試驗：測定產(chǎn)生 IgM 型抗體的細胞，只加細胞和補體 ； 間接溶血空斑試驗：檢測產(chǎn)生 IgG 或 IgA的細胞，加靶細胞、顯斑劑、補體； 顯斑劑：抗各類 Ig 高純度的抗血清,第九十六頁，共一百一十五頁。,第九十七頁，共一百一十五頁。,第九十八頁，共一百一十五頁。bāo)，又可檢測抗體分泌量。i)實驗,體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原(k224。,第一百零一頁，共一百一十五頁。bāo)熒光,測發(fā)光強度,測CPM值,形態(tài)法 酶釋法 熒光法 同位素法 化學(xué)發(fā)光法,NK細胞活性測定,靶細胞溶解,常用靶細胞: K562細胞株,第一百零二頁，共一百一十五頁。ng)三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法 中性粒細胞功能檢測技術(shù) 巨噬細胞功能檢測技術(shù),第一百零三頁，共一百一十五頁。,(1) 細胞(x236。ngbǎn)法,濾膜滲透法（Boyden 小室法）,第一百零六頁，共一百一十五頁。n yu225。,巨噬細胞功能(gōngn233。n)巨噬細胞的功能。zh236。d236。,（4）細胞毒作用(zu242。,第一百一十二頁，共一百一十五頁。 腫瘤、免疫缺陷病等疾病的診斷和疾病預(yù)后監(jiān)測。,第一百一十三頁，共一百一十五頁。ng)總結(jié),細胞因子及免疫細胞功能檢測方法簡介。（3）qPCR結(jié)果分析—— 相對定量解析。結(jié)論：JUN處理后表達水平是處理前的5.3倍。溶血空斑實驗(sh23
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