【正文】 也就是我們?cè)诿庖叱恋韺?shí)驗(yàn)中所稱(chēng)的 “ 帶現(xiàn)象 ” 。 ? 總之，將圍繞改善免疫測(cè)定的特異性和敏感性來(lái)制備基因工程片斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將有越來(lái)越多的酶免疫測(cè)定方法建立在基因工程酶或其融合蛋白的基礎(chǔ)之上。 ? 759份各類(lèi)臨床樣品包括 401份 HIV1感染不同階段病人樣品， 204分 HIV2感染不同階段病人樣品，和 154份與 HIV無(wú)關(guān)的其他疾病患者的樣品的檢測(cè)結(jié)果。 HIV ，可測(cè)特異性 HIV 群的抗體 和 HIV 1M群的抗體。 15 HIVELISA試劑 ? 目前對(duì) HIV的檢測(cè)原料有了較大改進(jìn)，主要如下： ? （ 1）可用于檢測(cè)血清或血漿中 HIV IgM亞特異性抗體和檢測(cè) HIV 2和多種亞型。這種重組蛋白，即基因工程雙功能試劑，在此基礎(chǔ)上，建立了快速，靈敏和特異的自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（ AGEN） . 13 HIVELISA抗原 /抗體試劑 ? 1998年 ,美國(guó)首先研制第四代試劑 ,對(duì)檢測(cè)HIV的同時(shí)檢測(cè) P24(核心 )抗原 ,故稱(chēng) HIV抗原 /抗體試劑 ,國(guó)內(nèi)已有引進(jìn) . ? 抗原組成 : gp160gp36gp170和單克隆抗 p24抗體包被 . 14 P24抗原測(cè)定 ? 采用夾心法 ELISA,即將將純化的已知抗體包被，當(dāng)加入帶測(cè)血清后，若血清中含有P24與包被抗體形成抗原抗體復(fù)合物，再加入酶（ HRP）標(biāo)記 HIV抗體。 * NS4 為倆個(gè)片斷的合成多肽，去掉了非特異性反應(yīng)的區(qū)域，加強(qiáng)了試劑的靈敏度和特異性。 ? 抗原組合：除有 C 1003 C22 C33 外又增加了 core 和 NS3 NS4 NS5 ? 特點(diǎn)： *core NS3 NS5由 Baculovirus 重組表達(dá)，沒(méi)有非特異性的 載體，試劑特異性高 ，重組的蛋白經(jīng)融合形成大分子抗原，利于提高檢測(cè)靈敏度。 9 HCVELISA試劑盒 ? 用基因重組的 HCV結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白抗原包被固相載體。 ? 約由 20%的病人不出現(xiàn)抗體。 7 HCVELISA試劑 ? HCV目前尚不能體外培養(yǎng)，只能用基因工程或化學(xué)合成方法獲取 HCV結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)區(qū)的各種抗原片斷，已知 HCV基因組有 7個(gè)功能區(qū)組成：核心、 E E2/NS1 NS2 NS3 NS4 NS5(有分為 NS5a和 NS5b)區(qū)，合成抗原的優(yōu)點(diǎn)是易于純化，特異性好，抗原抗體反應(yīng)強(qiáng)。 ? 酶表抗體為與 HBsAg有不同結(jié)合位點(diǎn)的鼠復(fù)合單位。 4 基因工程試劑對(duì)免疫測(cè)定技術(shù) 發(fā) 展 的 影 響 ? 免疫測(cè)定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，所以任何優(yōu)質(zhì)的診斷試劑離不開(kāi)優(yōu)質(zhì)的原料，如抗原抗體，酶等。由于其試劑穩(wěn)定、易保存，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果判斷較客觀等因素，已廣泛應(yīng)用在免疫學(xué)檢驗(yàn)的各領(lǐng)域中。然而，影響 ELISA試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，故加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。以前用于免疫測(cè)定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動(dòng)物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過(guò)各總化學(xué)合成方法制備。 ? 可測(cè)得 HBsAg變異樣品。 8 HCVELISA試劑盒： ? 由美國(guó) ortho公司克隆 C1003抗原幾個(gè)片斷與人超氧化物歧化酶（ SOD）結(jié)合。 IgM抗 C100急性期檢出率只有64%。 ? 抗原組合：核心區(qū)（ C區(qū)）多肽 C22 NS區(qū)多肽 C33 C1003和 NS 511 ? 增加 C22區(qū)和 C33區(qū)后，抗體出現(xiàn)早，有助早期診斷，提高陽(yáng)性率。 * NS3 區(qū)增加了氨基酸片斷（比例十分重要）。 11 HCV—ELISA 試劑盒 ? 美國(guó)新近推出一種包括 HCV基因組 7個(gè)功能區(qū)所有免疫決定基的單一融合蛋白，稱(chēng)為多決定基融合抗原，采用表面活性劑處理分界病毒表面復(fù)合物，釋放 HCV核心抗原（ core）并用 ELISA法，靈敏度可達(dá) 500拷貝 /ml，已接近核酸擴(kuò)增檢測(cè)水平。在抗原上又結(jié)合了酶標(biāo)記的抗體，加底物 顯色后在酶標(biāo)儀上讀結(jié)果。 ? （ 2）標(biāo)記的抗原： HIV1B亞型 gp41和 P24的 HIV1重組融合蛋白。 16 。 ? 特異性： % 靈敏度： 100% ? 對(duì)歐洲血液中心的 8842份常規(guī)鮮血者樣品用 HIV，并經(jīng)確認(rèn)實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果。 19 發(fā)展趨勢(shì)如下 ： ? 1）、由單一病原蛋白向多決定簇融合蛋白轉(zhuǎn)變，并盡可能包括病原體基因組功能區(qū)的所有的能引起肌體免疫應(yīng)答的決定簇。 20 二、 試劑盒的方法學(xué)設(shè)計(jì) ? 目前， ELISA的測(cè)定模式，主要有雙抗體夾心法測(cè)定抗原，如HBsAg,HBeAg,AFP,HCG等；間接法測(cè)定抗體如 HCV ,抗 HIV 等；雙抗體夾心法測(cè)抗體如 HBs，競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體，如 HBe,抗 HBc等；競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原，如激素等小分子。 ? Ab+Ag+Ab*→ AbAb*+Ab*Ag (1) Ab 25 圖 2 二步法 ELISA抗原濃度與顯色 變化的反映曲線(xiàn) 26 灰區(qū)概念：合并二種方法 ? 一步法試劑其反應(yīng)平衡點(diǎn)為圖中反應(yīng)曲線(xiàn) A點(diǎn) ,處在抗原抗體反應(yīng)的上坡圖中，故受反映條件的改變而影響 A值 ? 二步法抗原抗體反應(yīng)已達(dá)反應(yīng)的平臺(tái)期 ? 從圖見(jiàn)一步法 A點(diǎn)則受反應(yīng)條件的改變而影響 A值。 ? 以上一般以 S值確定的灰區(qū)范圍比 CV值確定值要大。 30 （ 3） .本底 ? 與一步發(fā)試劑盒相比，因二步法試劑盒標(biāo)本孵育時(shí)間長(zhǎng)。 ? 全自動(dòng)酶免分析儀的特點(diǎn) ①、加液的精密度： ②、始終如一的洗滌： ③、環(huán)境控制： ④、 QC特性 /過(guò)程安全性 32 酶標(biāo)儀的簡(jiǎn)易校準(zhǔn)和質(zhì)量控制 ? 移液器 ? 水浴箱 ? 洗板機(jī) 33 ? 酶標(biāo)儀的簡(jiǎn)易校準(zhǔn)和質(zhì)量控制 濾光片波長(zhǎng)精度檢查 通道差和孔間差檢測(cè) 零點(diǎn)漂移即儀器穩(wěn)定性觀察 精密度評(píng)價(jià) 線(xiàn)性測(cè)定 雙波長(zhǎng)測(cè)定評(píng)價(jià) 34 四、開(kāi)展質(zhì)量控制前的準(zhǔn)備 ? 檢驗(yàn)工作的質(zhì)量控制應(yīng)包括實(shí)驗(yàn)室工作的全過(guò)程，只有建立在完善的 質(zhì)量管理工作基礎(chǔ)之上，才能對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。 ? 病毒性肝炎酶免疫檢驗(yàn)中，有高值、中值、低值的質(zhì)控物，我們認(rèn)為其中以低值的質(zhì)控物為最重要， 設(shè)置臨界于 cutoff值（ CO值 ）的低值弱陽(yáng)性質(zhì)控物是室內(nèi)質(zhì)控的關(guān)鍵 。 40 cut off (CO)值又稱(chēng)臨界值 或陽(yáng)性與陰性界限值 CO 值計(jì)算實(shí)例：（以?shī)A心法為例） ? 1）依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)規(guī)定 S/N ≥2 .1 為陽(yáng)性 .（ S:樣品， N：陰性對(duì)照） 因?yàn)?S ≥ N 判斷為陽(yáng)性 , 所以 S = N 為陰陽(yáng)性結(jié)果分界點(diǎn)，即 CO值 . CO (cut off) 值 = N 當(dāng) S≥CO值時(shí)，判為陽(yáng)性； SCO值時(shí)，判為陰性 ? 2）樣品結(jié)果表示法： S/CO 值 S/CO = 樣品 A值 247。 為陰陽(yáng)性結(jié)果分界點(diǎn)，即 CO值 . CO (cut off) 值 = N247。 試劑盒的質(zhì)檢 43 五、室內(nèi)質(zhì)控步驟 ? 根據(jù)英國(guó) Whitehead的意見(jiàn)，室內(nèi)質(zhì)控分為以下幾個(gè)階段： 最佳條件下的變異 (optimal condition variation,OCV) 常規(guī)條件下已知值質(zhì)控血清的變異 (routine condition variationknown,RCVK) 常規(guī)條件下未知值質(zhì)控血清的變異 (routine condition variationunknown,RCVu) 病人結(jié)果的資料統(tǒng)計(jì)應(yīng)用 (statistics