實(shí)驗(yàn)二-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、酶切鑒定(已修改)
2025-08-16 15:22 本頁面
【正文】 實(shí)驗(yàn)二 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、酶切鑒定第一節(jié) 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)目的：1．了解PCR基因擴(kuò)增技術(shù)在DNA操作中的重要性及應(yīng)用范圍。2．熟悉PCR基因擴(kuò)增的基本原理。3．掌握PCR基因擴(kuò)增技術(shù)的具體操作過程。原理：聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR技術(shù)）實(shí)際上是在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。在反應(yīng)中混合下列物質(zhì)：模板DNA 、四種dNTP(包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、引物引物Taq DNA 聚合酶、緩沖液及Mg2+(MgCl2)，然后經(jīng)下列過程大量擴(kuò)增靶DNA，類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性－退火－延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。試劑：（1）TaKaRa Taq (5U/ ml)（2）10PCR緩沖液(Mg2+ Plus)（3）dNTP混合液(each 10mM)（4）DNA模板 (10ng)（5）引物引物名稱引物序列(5′－3′)339。 的位置(nt)復(fù)性溫度(℃)產(chǎn)物長度(bp)相互覆蓋長度(bp)Mit 1FCTC CTC AAA GCA ATA CAC TG61158802204Mit 1RTGC TAA ATC CAC CTT CGA CC1411Mit 2FCGA TCA ACC TCA CCA CCT CT124558802Mit 2RTGG ACA ACC AGC TAT CAC CA2007操作步驟：1. Eppendorf離心管內(nèi)加入PCR混合液25 181。l混勻，用100181。l礦物油覆蓋于反應(yīng)混合液之上，以防止反應(yīng)過程水分蒸發(fā)。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系各成分名稱反應(yīng)體系各成分濃度各成分體積（181。l）PCR緩沖液10 dNTP200 nmol/LMgCl225 umol/L前向引物10 umol/L反向引物10 umol/LTaq 聚合酶5 U/ul模板DNA50ng/ulddH2O
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