[理學(xué)]如何做好酶切(已修改)
2025-08-29 03:34 本頁面
【正文】 該問題看似什么簡單： DNA中加上酶，然后保溫一段時(shí)間就可以了。但是在實(shí)際操作過程中，我們不斷聽到：切不動，裝不上。問題在什么地方？能系列生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶的公司國際上，就那么幾個(gè)，位列前3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。這些公司提供酶的品質(zhì)一般都能得到保證。您可以懷疑酶的質(zhì)量問題，但是更多的問題來源于模板是否合適酶切要求。下面幾點(diǎn)對你的酶切是有幫助的。 1) 成功酶切的關(guān)鍵是準(zhǔn)備好模板DNA。DNA樣品中不能含有有機(jī)溶劑（會使酶變性或產(chǎn)生星號貨性），不能含有干擾酶活性的污染物質(zhì)，不能含有高濃度的EDTA (TE中的EDTA濃度較低，對Mg的濃度影響較小)；同時(shí)要對DNA甲基化程度及其對酶切效率的影響要做到心中有數(shù)。 2) 選用合適的酶。根據(jù)酶切序列選用，特別注意選用甲基化對酶活性的干擾。 3) 正確使用和保存酶。酶需要保存在20度的低溫環(huán)境中，只是在需要用酶才從冰箱中取出來。運(yùn)輸和臨時(shí)存放時(shí)需要將酶至于冰上。手拿酶管時(shí)不要接觸酶管下步含酶的部分，移酶時(shí)盡可能用長TIP, 避免污染。用完后需要及時(shí)送回原處。注意：酶通常是最后加。4) 反應(yīng)體積需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，常?guī)的酶切一般要維持在1050ul，酶切鑒定1020ul就可以了。5) 模板濃度問題：濃度過
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