實(shí)驗(yàn)二-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、酶切鑒定(完整版)
【正文】 umol/L反向引物10 umol/LTaq 聚合酶5 U/ul模板DNA50ng/ulddH2O合計(jì)252．將Eppendorf離心管放入PCR儀反應(yīng)倉(cāng)中。原理：聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR技術(shù)）實(shí)際上是在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴(lài)于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。在反應(yīng)中混合下列物質(zhì)：模板DNA 、四種dNTP(包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、引物引物Taq DNA 聚合酶、緩沖液及Mg2+(MgCl2)，然后經(jīng)下列過(guò)程大量擴(kuò)增靶DNA，類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。3．設(shè)置PCR反應(yīng)條件為：4．PCR產(chǎn)物分析：％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物的量、引物擴(kuò)增的特異性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA的量粗略計(jì)算PCR產(chǎn)物的總量，電泳方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的瓊脂糖電泳。3．引物二聚體 產(chǎn)生引物二聚體的原因有：兩條相同的引物或者不同引物分子之間存在較多的堿基配對(duì)，特別是引物3′端有互補(bǔ)區(qū)域；PCR反應(yīng)體系中引物與模板比例過(guò)高；PCR反應(yīng)過(guò)程中退火溫度設(shè)定過(guò)低或循環(huán)次數(shù)過(guò)多。 ④小量分裝所有試劑。然后加熱去除UDG活性，再做PCR， 即可防止PCR產(chǎn)物污染。原理：線(xiàn)粒體12S rRNA基因如無(wú)A1555G突變，則有BsmAI識(shí)別位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物被酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)兩個(gè)片段，如12S rRNA基因發(fā)生A1555G突變，則無(wú)BsmAI識(shí)別位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物不被酶切，瓊脂糖凝膠電泳僅見(jiàn)一個(gè)片段。3．以樣品Ⅰ、未酶切PCR產(chǎn)物和DNA % 瓊脂糖凝膠電泳。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可以有很多原因，首先考慮是DNA本身的原因如DNA不純、缺少識(shí)別序列、DNA甲基化等，另外限制性?xún)?nèi)切酶部分失活，酶存在星號(hào)活性，反應(yīng)條件不合適等，都會(huì)使DNA酶切失敗。許多瓊脂糖鏈依氫鍵及其它力的作用使其互相盤(pán)繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。（2）樣品制備與加樣：將DNA溶液按5:1溶解于6Loding Buffer緩沖液中，上樣于瓊脂糖凝膠孔中。對(duì)大分子的分離可用電壓5V/cm。在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，DNA分子的電泳遷移率與其分子量的常用對(duì)數(shù)成反
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