【正文】 Chapter 4 Modification of Enzyme Molecule酶的分子修飾Contents of chapter 4什么是酶分子修飾酶分子修飾的基本要求和條件酶分子的修飾方法酶修飾后的性質(zhì)變化GoGoGoGo酶的定向進(jìn)化附：酶的活性中心Go 什么是酶分子修飾？o 通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程稱(chēng)為酶分子修飾。 即：在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。酶化學(xué)修飾原因1． 穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)的需要。2． 作用的最適條件不符。3． 酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。4． 臨床應(yīng)用的特殊要求。酶修飾的方向1)通過(guò)分子修飾的方法來(lái)改變已分離出來(lái)的天然酶的活性。 2)通過(guò)基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。酶分子修飾的意義o 提高酶的 活力 activityo 增強(qiáng)酶的 穩(wěn)定性 stabilityo 降低或消除酶的 抗原性 immunological propertyo 研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對(duì)酶分子空間構(gòu)象的影響 structure 一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生 “ 剛性 ” 結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑 大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑， “ 遮蓋 ” 了酶的活性部位。酶分子修飾的原理：三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶 酶化學(xué)修飾后通過(guò)兩種途徑抗蛋白水解酶：1. 大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子。 “ 遮蓋 ” 酶分子上敏感鍵免遭破壞。2. 酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1. 酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。 破壞了抗原決定簇 —— 抗原性降低乃至消除 “ 遮蓋 ” 了抗原決定簇 —— 阻礙抗原、抗體結(jié)合2. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成 “ 緩沖外殼 ” ，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。 酶分子修飾的基本要求和條件 o 對(duì)酶分子進(jìn)行修飾必須在修飾原理、修飾劑和反應(yīng)條件的選擇以及酶學(xué)性質(zhì)等方面都要有足夠的了解。一． 修飾劑的要求二． 酶性質(zhì)的了解三． 反應(yīng)條件的選擇四． 酶修飾方法修飾劑的要求1． 修飾劑的分子量、修飾劑鏈的長(zhǎng)度對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性。2． 修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置。3． 修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件 。酶的性質(zhì)n （ 1） 酶的穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、作用溫度、 pH、抑制劑等。 n （ 2） 酶活性中心的狀況 活性中心基團(tuán)、輔因子等。其他如分子大小、性狀、亞基數(shù)等。n （ 3） 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性等。酶分子修飾的條件o 修飾反應(yīng)盡可能在 酶穩(wěn)定條件 下進(jìn)行，并盡量 不破壞酶活性功能的必需基團(tuán) ，使 修飾率高 ，同時(shí)酶的 活力回收高 。n （ 1） pH與離子強(qiáng)度 o pH決定了酶蛋白分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)。由于它們的解離狀態(tài)不同，反應(yīng)性能也不同。n （ 2） 修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間 o 嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間可以減少以至消除一些非專(zhuān)一性的修飾反應(yīng)。n （ 3） 反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例 酶修飾方法選擇1． 酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾 2． 有機(jī)大分子對(duì)酶的化學(xué)修飾3． 蛋白質(zhì)類(lèi)及其他。 酶分子的修飾方法 o 金屬離子置換修飾 ,o 大分子結(jié)合修飾 (共價(jià) /非共價(jià) )o 側(cè)鏈基團(tuán)修飾o 肽鏈有限水解修飾o 氨基酸置換修飾o 酶分子的物理修飾 (1) 酶的金屬離子置換修飾o 把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法稱(chēng)為金屬離子置換修飾。o 有些酶分子中含有金屬離子，而且往往是酶活性中心的組成部分，對(duì)酶催化功能的發(fā)揮有重要作用。 α 淀粉酶中的鈣離子（ Ca2+），谷氨酸脫氫酶中的鋅離子 (Zn2+)，過(guò)氧化氫酶分子中的鐵離子 (Fe2+)，?；被崦阜肿又械匿\離子（ Zn2+） ,超氧化物歧化酶分子中的銅、鋅離子 (Cu2+,Zn2+) o 若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會(huì)喪失其催化活性。如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。o 若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。金屬離子置換修飾的過(guò)程 p a. 酶的分離純化 ：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過(guò)分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。p b. 除去原有的金屬離子 ：在經(jīng)過(guò)純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（ EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與 EDTA等形成螯合物。通過(guò)透析、超濾、分子篩層析等方法，將 EDTA金屬螯合物從酶液中除去。此時(shí)，酶往往成為無(wú)活性狀態(tài)。p c. 加入置換離子 ：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過(guò)金屬離子置換后的酶。p 金屬離子置換修飾只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)中本來(lái)含有金屬離子的酶。p 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。 金屬離子置換修飾的作用：(1)闡明金屬離子對(duì)酶催化作用的影響：(2)提高酶活力：(3)增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性：(4)改變酶的動(dòng)力學(xué)特性：o 將鋅型蛋白酶的 Zn2+除去，然后用 Ca2+置換成鈣型蛋白酶，則酶活力可提高 2030%。若將鈣型蛋白酶制成結(jié)晶，則其酶活力比鋅型蛋白酶結(jié)晶的酶活力提高 23倍。 (2) 酶的大分子修飾o 使用一些能與酶非共價(jià)地相互作用而又能有效地保護(hù)酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它們既能通過(guò) 氫鍵 固定在酶分子表面，也能通過(guò) 氫鍵 有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力。o 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過(guò)調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來(lái)保護(hù)酶的活力。o 另一類(lèi)添加物就是蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子之間相互作用時(shí)，其表面區(qū)域內(nèi)排除了水分子，因而增加了相互作用力，其穩(wěn)定性也就增加了。非共價(jià)修飾采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法o 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通過(guò) 共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層。o 例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶 ，不僅可以 降低或消除酶的抗原性 ，而且提高了 抗蛋白酶的能力 ，延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的 半衰期從而提高了酶藥效。o 每分子核糖核酸酶與 ，可以使酶活力提高到原有酶活力的 ；o 每分子胰凝乳蛋白酶與 11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的 共價(jià)修飾大分子修飾 (共價(jià) )的過(guò)程o 修飾劑的選擇 ：大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（ PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（ Ficoll）、葡聚糖、環(huán)狀糊精、肝素、羧甲基纖維素、聚氨基酸等。要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。o 修飾劑的活化 ：作為修飾劑中含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過(guò)活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。 o 修飾 ：將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過(guò)分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、 pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。 o 分離 ：需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開(kāi)，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。 應(yīng)用：消除了抗原性如： PEG－超氧化物歧化酶（