【正文】 　　　　 第十三章遺傳修飾動物模型Date 1第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物的概念及其發(fā)展簡史轉(zhuǎn)基因動物 (transgenicanimal)：是指基因組中整合有外源基因、外源基因能夠表達(dá)并按孟德爾定律遺傳的一類動物。轉(zhuǎn)基因 (transgene)：將外源基因整合入動物基因組中的操作。嵌合體動物 (chimera)：部分組織中整合有外源基因的動物。Date 2第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物的概念及其發(fā)展簡史轉(zhuǎn)基因的三個層次：細(xì)菌轉(zhuǎn)基因離體真核細(xì)胞轉(zhuǎn)基因生物轉(zhuǎn)基因Date 3第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物的概念及其發(fā)展簡史 人類疾病動物模型 (Animal models of human diseases)是指在醫(yī)學(xué)研究中，在動物身上建立，或形成類似人類疾病動物。通過動物模型直接，或間接反映疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，在了解疾病的基礎(chǔ)上開創(chuàng)和改進(jìn)、優(yōu)化疾病的治療。 Date 4第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物的概念及其發(fā)展簡史? 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是在 基因工程 和 胚胎工程 的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的? 1961年， Tarkowski等將小鼠卵裂期不同品系的胚胎細(xì)胞融合后，形成了嵌合體小鼠；? 1974年， Jaenisch和 Mintz將 SV40DNA注射入小鼠囊胚中，在小鼠的體細(xì)胞檢測到病毒DNA序列；? 1980年， Gordon首次將重組的 DNA注射到小鼠體細(xì)胞中；Date 5第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物的概念及其發(fā)展簡史1982年， Palmiter將金屬巰基 (MTI)基因啟動子控制的大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入侏儒小鼠的受精卵，得到的 7只轉(zhuǎn)基因鼠中，有 6只生長明顯加快，體重遠(yuǎn)大于正常對照，被稱為 “ 超級小鼠 ” (Supermice)。82年以后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了大力的推廣和研究，至今已制備出小鼠、大鼠、雞、兔、豬、羊、魚等轉(zhuǎn)基因品系。Date 6? 第一例嵌合體小鼠? 1974年最早把猿猴病毒 40(SV40)注入小鼠囊胚腔中得到部分組織中含有 SV40DNA的嵌合體小鼠。但無任何表型改變。? 第一個轉(zhuǎn)基因小鼠系? 1976年建立了世界上第一個轉(zhuǎn)基因小鼠系，這些小鼠基因組中插人了莫氏白血病病毒基因。他們是運用反轉(zhuǎn)錄病毒與小鼠卵裂球共培養(yǎng)把外源 DNA插入到小鼠的基因組中。? 第一例顯微注射法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠? 1980年， Gordn等把 SV40DNA顯微注射到小鼠受精卵的原核中，獲得了兩只轉(zhuǎn)基因小鼠，創(chuàng)建了顯微注射轉(zhuǎn)基因方法。Date 7? “ 超級鼠 ” 　 1982年， Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生長激素基因?qū)胄∈笫芫眩@得了成年體重是對照組小鼠 2倍的 “ 超級鼠 ” ，首先證明外源基因可在受體中表達(dá)，并且表達(dá)產(chǎn)物具有生物活性。? 轉(zhuǎn)基因家畜的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因家兔、綿羊和豬 (Hammer等， 1985)、牛 (Bondioli等，1988)和山羊 (Ebert等， 1991)等相繼出世。Date 8Date 9Date 10利用轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)重組蛋白 1987年， Simons等在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中得到綿羊的 β球蛋白， 1988年，該研究小組又從轉(zhuǎn)基因綿羊的乳汁中得到了 α 抗胰蛋白酶。目前，已有數(shù)十種蛋白實現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)。轉(zhuǎn) YAC的轉(zhuǎn)基因小鼠 近 10年內(nèi)，陸續(xù)出現(xiàn)用全長酵母人工染色體（ YAC） DNA來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠。Date 11? 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)－國內(nèi)首例綠色熒光蛋白 “ 轉(zhuǎn)基因” 克隆豬? 綠色熒光蛋白－豬胎兒成纖維細(xì)胞－克隆Date 12? 1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生。轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌 α抗胰蛋白酶。Date 13? 2022年， FDA批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因鮭魚Date 14轉(zhuǎn)基因動物的意義：基因的整體功能的闡明只有在活體內(nèi)通過整體動物的研究才能達(dá)到；轉(zhuǎn)基因動物是生物醫(yī)學(xué)研究、新藥開發(fā)、毒理學(xué)、安全性評價的重要工具。轉(zhuǎn)基因動物用途：（ l）疾病型轉(zhuǎn)基因動物；（ 2）利用轉(zhuǎn)基因動物制藥；（ 3）動物改良型；（ 4）基礎(chǔ)生物學(xué)研究第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動物的概念及其發(fā)展簡史Date 15? （ l）疾病型轉(zhuǎn)基因動物? 替代：– 避免了人體實驗造成的風(fēng)險和倫理問題 。– 潛伏期長，病程長和發(fā)病率低的疾病? 可控：– 品系，感染病原體– 實驗環(huán)境? 方便：– 樣品收集– 結(jié)果分析容易（統(tǒng)計）；? 人畜共患病比較，研究疾病機(jī)理Date 16? （ 2）利用轉(zhuǎn)基因動物制藥：? 生物反應(yīng)器重組蛋白藥物 ? 歐洲醫(yī)藥評價署人用醫(yī)藥產(chǎn)品委員會 2022年 6月 2日首次批準(zhǔn)了用轉(zhuǎn)基因山羊奶研制而成的抗血栓藥物 Atryn（抗凝血酶）上市 ? 目前世界上還有利用轉(zhuǎn)基因綿羊、牛和兔乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人 α抗胰蛋白酶（抗蛋白酶缺乏性肺氣腫藥物）、重組組織血纖維蛋白溶酶原激活劑（抗栓藥）和人 C1抑制劑（治療血管神經(jīng)性水腫的藥物）等重組蛋白藥物也已經(jīng)完成或進(jìn)入臨床 Ⅲ 期試驗，特別是治療性 抗體 藥物，發(fā)展?jié)摿Ω蟆?Date 17? 目前已在下列動物的乳汁中生產(chǎn)出一些人類蛋白質(zhì)藥物：? 牛：抗凝血酶、纖維蛋白原、人血清白蛋白、膠原蛋白、乳鐵蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白 C等；? 山羊：抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、血清白蛋白、組織纖溶原激活因子、單克隆抗體等；? 綿羊：抗胰蛋白酶、凝血因子 Ⅸ 、蛋白 C；? 豬：凝血因子 Ⅸ 、蛋白 C、纖維蛋白原、血紅蛋白。Date 18第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動物的基本步驟外源基因的轉(zhuǎn)基因動物基因的功能Date 19第二節(jié)　　研制轉(zhuǎn)基因動物的基本步驟基本原理 將改建后的目的基因用顯微注射等方法注入實驗動物的受精卵，然后將此受精卵再植入受體動物的輸卵管中，使其發(fā)育成攜帶有外源基因的轉(zhuǎn)基因動物，人們可以通過轉(zhuǎn)入外源基因培育優(yōu)良品種的工程動物等。Date 20目的基因的分離與克隆表達(dá)載體構(gòu)建卵母細(xì)胞的收集體外成熟培養(yǎng)基因?qū)朕D(zhuǎn)基因胚胎的獲得獲得子代動物轉(zhuǎn)基因胚胎的移植轉(zhuǎn)基因整合表達(dá)的檢測獲得轉(zhuǎn)基因動物受體動物的選擇Date 21構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體含有外源目的基因的重組載體導(dǎo)入受體胚胎轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育及鑒定通過轉(zhuǎn)基因動物表型分析研究外源基因的功能Date 22轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)路線? 經(jīng)典的技術(shù)路線 目的基因顯微注射已交配的 受體動物 供體動物 輸卵管 轉(zhuǎn)基因動物取出 移植 妊娠缺點：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低 。受精卵Date 23轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)路線 (續(xù) )? 整合胚胎移植的技術(shù)路線轉(zhuǎn)基因動物 受體動物子宮目的基因 非手術(shù)胚胎移植體外受精 體外培養(yǎng) 檢測 卵子 受精卵 多細(xì)胞胚胎 整合外源基因精子 或囊胚 的胚胎優(yōu)點：受精卵的成活率高達(dá) 90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。Date 24轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)路線（續(xù)）? 整合卵受精的技術(shù)路線 ：目的基因 轉(zhuǎn)基因動物導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒 1