westernblot詳解及問題分析(已修改)
2025-05-27 00:44 本頁(yè)面
【正文】 蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及 常見問題分析 張紹進(jìn) Western Blot ? Western Blot簡(jiǎn)介 ? Western Blot一般流程 ? Western Blot常見問題分析 Western Blot Western Blot 簡(jiǎn)介： ? 印跡法（ blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。 ? 1975年， Southern建立了將 DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（ NC膜）上，并利用 DNA－ RNA雜交檢測(cè)特定的 DNA片段的方法，稱為 Southern印跡法。 ? 而后人們用類似的方法，對(duì) RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì) RNA的印跡分析稱為 Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為 Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為 Eastern印跡法。 Western Blot Western Blot 基本原理 Western Blot Western Blot 優(yōu)點(diǎn) ? 高分辨率的電泳技術(shù) ? 特異敏感的抗原 抗體反應(yīng) ? 15ng中等大小的靶蛋白 Western Blot Western Blot應(yīng)用 ? 目的蛋白的表達(dá)特性分析 ? 目的蛋白與其它蛋白的互作 ? 目的蛋白的組織定位 ? 目的蛋白的表達(dá)量分析 Western Blot Western Blot 流程 ?蛋白樣品的制備 ?SDSPAGE ?轉(zhuǎn)膜 ?封閉 ?一抗雜交 ?二抗雜交 ?底物顯色 Western Blot ? 通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白 ? 水溶液提取法 針對(duì)水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。 ? 有機(jī)溶劑提取法 對(duì)于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 ? 通過層析或電洗脫法制備目的蛋白 蛋白樣品的提取 Western Blot 蛋白樣品的定量 ? 目前常用比色法測(cè)定樣品蛋白的含量： Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）、 Lowry法（ Folin酚試劑法）、 BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測(cè)定樣品濃度。 ? 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的各種方法匯總： Western Blot 蛋白樣品的變性 ?
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