westernblot詳解及問題分析-全文預(yù)覽
【正文】 抗與底物反應(yīng)顯色 ?辣根過氧化物酶法（ HRP） ?堿性磷酸酶法（ AP） ?化學(xué)發(fā)光顯色法 (HRP) Western Blot 膜解吸方法（膜的重復(fù)利用） ? 通過加熱和去污劑進行解吸 原理： 組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。 ? 回收一抗溶液，用 TBST漂洗膜 3次，每次 10min。 ?印度墨汁染色 只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記 A蛋白探 針的 Western印跡過程。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠 /膜疊層和施加電場的機械裝置不同。催化體系主要有化學(xué)催化（ AP— TEMED）和光化學(xué)催化（核黃素 —— TMTED）體系。 【 SDSPAGE基本原理 】 Western Blot 凝膠成分 ? 丙烯酰胺和 N,N’亞甲雙丙烯酰胺 ?? ? SDS ? 配膠的 Tris緩沖液 ? TEMED ? 過硫酸銨 ? Tris甘氨酸電泳緩沖液 Western Blot PAGE：聚丙烯酰胺凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 (polyacrylamide gel)是由單體丙烯酰 胺 (acrylamide，簡稱 Acr)和交聯(lián)劑 (crosslinker) N,N’亞甲基雙丙烯酰胺 (N,N’methylenebisacylamide， 簡稱 Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)的凝膠。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。 Western Blot 蛋白質(zhì) SDS膠束的特點： （ 1）具有相同的形狀，形狀像一個長橢圓棒 （ 2）平均 1g 蛋白質(zhì)結(jié)合 SDS （ 3）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基 SDS膠束基本上是相同的 （ 4）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比 Western Blot ? 不連續(xù)的電泳緩沖體系。 ? 按 1:1比例與蛋白質(zhì)樣品混合， 95～ 100℃ 加熱 5～ 15min，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為 2025μl，總蛋白量 20～50μg。 ? 通過層析或電洗脫法制備目的蛋白 蛋白樣品的提取 Western Blot 蛋白樣品的定量 ? 目前常用比色法測定樣品蛋白的含量： Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）、 Lowry法（ Folin酚試劑法）、 BCA法等。 ? 而后人們用類似的方法，對 RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對 RNA的印跡分析稱為 Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為 Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為 Eastern印跡法。 ? 1975年， Southern建立了將 DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（ NC膜）上，并利用 DNA－ RNA雜交檢測特定的 DNA片段的方法，稱為 Southern印跡法。 ? 有機溶劑提取法 對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 ? 蛋白質(zhì)濃度測定的各種方法匯總：
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