westernblot詳解及問題分析(存儲版)
【正文】 蛋白分子量 10KD時，減少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑的膜 2. 更換高 pH值 Buffer 3. 在陰極 buffer中加入 % SDS 可提高轉(zhuǎn)膜效率 4. 延長轉(zhuǎn)膜時間 Western Blot 1. 膜沒有均勻浸濕 2. 膜或者緩沖液污染 3. 封閉不充分 4. 抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng) 5. 抗體濃度過高 原因 對 策 1. 轉(zhuǎn)膜前用 100%甲醇將膜完全浸濕 2. 拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液 3. 檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng) 4. 雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度 背景太高 Western Blot 雜交信號很弱 1. 抗體保存不當(dāng) 2. 抗原不充足 3. 膜的漂洗過度 原因 對 策 1. 抗體長期保存應(yīng)在－ 70℃，使用前做效價檢測 2. 增加蛋白上樣量，做已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白的對照 3. 減少漂洗的時間和次數(shù) Western Blot 1. 一抗不是唯一特異的 2. 二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合 原因 對 策 1. 制備單克隆抗體或者重新選取合成抗原多肽的位點 2. 設(shè)立不加一抗，只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異結(jié)合 出現(xiàn)非特異帶 Western Blot Further Readings ? 生物秀 Western Blotting專題 ? ? Millipore的蛋白印跡手冊 ? ? BioRad的 western Blotting操作手冊 ? ? Western blot問題解答專帖 ? 謝謝大家！ 。 ? 回收一抗溶液，用 TBST漂洗膜 3次，每次 10min。尼龍膜和 NC膜的特點相似 ,主要用于核酸雜交。是良好的電泳介質(zhì)。 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 Western Blot SDSPAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入 SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液， SDS是一種很強的 陰離子表面活性劑 ，它可以 斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵 ，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)及 常見問題分析 張紹進 Western Blot ? Western Blot簡介 ? Western Blot一般流程 ? Western Blot常見問題分析 Western Blot Western Blot 簡介： ? 印跡法（ blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。但各有優(yōu)缺點，大家可以根據(jù)具體情況選取。 ? SDS— 蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳時，不再受蛋白質(zhì)電荷與形狀的影響，而只取決于蛋白質(zhì)分子量的大小?；瘜W(xué)惰性強，具有一定的機械強度和透明
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