westernblot詳解及問題分析(文件)
【正文】 原的結(jié)合。 ? 回收一抗溶液，用 TBST漂洗膜 3次，每次 10min。 Western Blot Western Blot結(jié)果分析 ? 目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫 Western Blot 轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少 1. 蛋白分子量 10KD 2. 蛋白的等電點 9 3. SDS濃度不合適 4. 凝膠太厚 原因 對 策 1. 蛋白分子量 10KD時，減少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑的膜 2. 更換高 pH值 Buffer 3. 在陰極 buffer中加入 % SDS 可提高轉(zhuǎn)膜效率 4. 延長轉(zhuǎn)膜時間 Western Blot 1. 膜沒有均勻浸濕 2. 膜或者緩沖液污染 3. 封閉不充分 4. 抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應 5. 抗體濃度過高 原因 對 策 1. 轉(zhuǎn)膜前用 100%甲醇將膜完全浸濕 2. 拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液 3. 檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應 4. 雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度 背景太高 Western Blot 雜交信號很弱 1. 抗體保存不當 2. 抗原不充足 3. 膜的漂洗過度 原因 對 策 1. 抗體長期保存應在－ 70℃，使用前做效價檢測 2. 增加蛋白上樣量，做已知標準量蛋白的對照 3. 減少漂洗的時間和次數(shù) Western Blot 1. 一抗不是唯一特異的 2. 二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合 原因 對 策 1. 制備單克隆抗體或者重新選取合成抗原多肽的位點 2. 設立不加一抗，只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異結(jié)合 出現(xiàn)非特異帶 Western Blot Further Readings ? 生物秀 Western Blotting專題 ? ? Millipore的蛋白印跡手冊 ? ? BioRad的 western Blotting操作手冊 ? ? Western blot問題解答專帖 ? 謝謝大家！ 。同時注意電泳槽裝置是否合適 SDSPAGE電泳 Western Blot 轉(zhuǎn)膜及抗體檢測 ? 凝膠腫脹或卷曲？ ? 條帶歪斜或漂移？ ? 單個或多個白點？ ? 轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱 ？ ? 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡 510min ? 電轉(zhuǎn)儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導致。 Western Blot 二
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