westernblot詳解及問題分析-預覽頁
【正文】 Western Blot 蛋白樣品的變性 ? 2 SDSPAGE上樣緩沖液： ? DTT可臨用前以 1： 4比例混合加入，亦可全部配好分裝， 20℃ 凍存。 ? 與強還原劑一起使蛋白分子氫鍵、疏水鍵打開，使蛋白質分子線性化。 強還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇， DTT） 可以 斷開二硫鍵破壞蛋白質的四級結構 。蛋白質的電泳遷移率主要決定于亞基 的相對分子質量，而與其所帶電荷的性質無關。 Western Blot 聚丙烯酰胺凝膠的聚合方式： ? 單體：丙烯酰胺（ Acr）； ? 交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（ Bis）； ? 催化劑：過硫酸胺或核黃素（ AP）； ? 加速劑：四甲基乙二胺（ TEMED）； ? 產物：三維網狀結構凝膠 ? 聚丙烯酰胺凝膠聚合機理是通過提供氧游離基 (free radicals)的催化，使體系發(fā)生氧化還原作用 (catalystredox systems)來完成的。 ? 常用的電泳轉移方法有 濕轉和半干轉 。 ? 各種膜的詳細特點介紹： ? Western Blot 濕轉系統(tǒng) Western Blot 半干轉移系統(tǒng) Western Blot ?麗春紅染色 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝酸纖 維素濾膜，換水幾次。 Western Blot 一抗、二抗孵育 ? 把 NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據膜面積以，搖床上平緩搖動，于室溫孵育 12小時或 4℃ 過夜。 ? 最后用 TBS漂洗膜 2次，每次 10min。 ? Western Blot結果分析軟件 GelPro Analyzer 4 綠色版（附動畫演示教程） Western Blot Western Blot常見問題分析 Western Blot SDSPAGE電泳 ? 膠不平？ ? 凝膠漏液？ ? 膠板洗刷干凈 ? 加入 AP和 TEMED的量要合適 ? 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 ? 溫度合適，受熱不均勻導致膠聚合不均勻 ? 兩塊玻璃板底部要對齊 Western Blot ? 條帶比正常的窄？ ? “ 微笑 ” 或 “ 倒微笑 ”條帶？ ? 凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩 ? 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲 ? 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一，純化樣品，調整鹽濃度 ? 膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應
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