【正文】 1 1 前言 大青葉 研究概況 來源及其藥材性狀 大青葉的來源頗多 ,全國各地有大青葉及其混淆品、代用品達 6 科 15種之多，這么多的同名異物品當作大青葉使用，其形成有著歷史的原因?！吨袊幍洹纷?1985版起明確規(guī)定十字花科植物 菘藍 的葉為大青葉正品 [1]。 干燥葉皺編成團塊狀，有時破碎，呈灰綠色或黃棕色。完整的葉呈長橢圓形至長圓狀倒披針形，長 4～ 11 厘米，寬 1～ 3 厘米，全緣或微波狀；先端鈍尖，基部漸狹，延成翼狀，上面有時可見點狀突起，下面中脈明顯。葉柄長 5～ 7 厘米，腹面稍凹下。質(zhì)脆易碎。氣微弱，味稍苦。以葉大、無柄、色暗灰綠者為佳。 大青葉的研究現(xiàn)狀 化學成分研究 近年來，對大青葉化學成分的文獻報道主要集中在生物堿、有機酸、苷類、甾醇等幾大類化合物上。 吲哚類生物堿：靛藍、靛玉紅、大青苷 B（有的也稱大黃素 B 和靛紅烷 B）、異靛藍。藥典 2021 版以靛玉紅作為大青葉藥材的質(zhì)量控制標準。靛玉紅及其同系物能夠抑制細胞周期蛋白依賴激酶，因而對慢性粒細胞白血病具有明顯的抑制作用。此外，靛玉紅還可以刺激感染流感病毒的支氣管上皮細胞中 T 細胞的表達和分泌，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用 [3]。 喹唑酮類生物堿：青黛酮、 4（ 3H） 喹唑酮、 2,4（ 1H,3H） 喹唑二酮、色氨酮 [4]。 有機酸類：丁香酸、水楊酸、鄰氨基苯甲酸、苯甲酸、棕櫚酸、煙酸、琥珀酸 [5]。 苷類：蕓苔葡萄糖硫苷、新蕓苔葡萄糖苷 [6]、腺苷、胞苷、尿苷、鳥苷 [7]。 無機元素：鋅、鐵、鈣、鎂、錳、銅、鉀、鈉等無機元素 [8]。 多糖類： 大量研究表明植物多糖是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑，廣泛存在于自然界。大青葉多糖是大青葉中含量較多的、免疫活性較強的一類物質(zhì) [9]。 其他：大青葉中還含有 10Hindolo(3,2b)quinoline[6]、 deoxyvascinone[6]、落葉松脂素 [6]、多種氨基酸 [10]、揮發(fā)性成分 [10]。 藥理作用研究 大青葉具有多種化學成分和藥理作用，其不同的活性成分、化學成分的生物活性不同，或藥效作用程度不一，即使同樣的化學成分也表現(xiàn)出不同的藥理活性，由此可見，大青葉可能是由多種化學成 分，通過多種途徑、多個靶點作用于機體來發(fā)揮藥效的。 抗菌作用：大青葉有抗病原微生物的作用。鄭劍玲等 [11]采用試管稀釋法測定大青葉的各級提取物 (水提液、乙醇提取液、正丁醇萃取液 )對金黃色葡萄球菌、腸炎桿菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度 (MIC)，實驗證明各級提取物對實驗菌分別有不同程度的抑菌作用．其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最為明顯。張連同 [12]用 K— B 紙片擴散法測定大青葉的水煎劑的體外抑菌活性，發(fā)現(xiàn)大青葉在體外對金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、甲型鏈球菌、乙型鏈球菌均有明顯抑菌作用。孫立新 [13]等則 以枯草桿菌和短小芽胞桿菌作為大青葉的藥理活性檢測指標。說明大青葉類藥材具有廣譜的抑菌作用。 抗病毒作用：采用大青葉注射液做抗病毒試驗，證明其對甲型流感病毒、乙型腦炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒有抑制感染并有抑制增殖作用 [14]。劉盛等 [15]選用雞胚法考察不同性質(zhì)的大青葉對甲型流感病毒 (A1 京防 86— 1)的抑制作用。其血凝滴度實驗結(jié)果表明大多數(shù)藥材對甲型流感病毒有直接作用、治療作用和預防作用。王學兵 [16]等通過觀察 PK15細胞病變效應（ CPE）來評價大青葉多糖的不同加藥方式體外對豬細小病毒（ PPV）的阻斷和抑制大青葉多糖提取工藝研究 2 作用，結(jié)果表明大青葉多糖在對細胞的安全濃度范圍內(nèi)，對豬細小病毒有明顯的阻斷作用和抑制作用。 抗內(nèi)毒素活性：大青葉性味苦寒，具清熱解毒涼血利咽的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學關(guān)于清熱解毒功效的闡釋目前主要集中于以下兩點：一是抗細菌內(nèi)毒素作用；二是抗病原微生物作用，尤其是抗內(nèi)毒素活性為該類中藥的重要特征 [14]。劉云海等 [17]采用動態(tài)濁度法測定細菌內(nèi)毒素濃度，觀察大青葉不同化學部位對放線菌素 D 敏化小鼠內(nèi)毒素致死攻擊的保護作用，并以內(nèi)毒素制備家兔發(fā)熱模型，測定其肛溫變化，實驗發(fā)現(xiàn)大青葉的正丁醇萃取部位能直接 中和降解內(nèi)毒素，顯著降低內(nèi)素的致熱性和致死性，說明其具有顯著的體內(nèi)、外抗內(nèi)毒素活性。 對免疫系統(tǒng)的作用：大青葉用來治療各種感染性疾病由來已久。為了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作用，張淑杰等 [18]觀察了大青葉水煎劑對小鼠免疫細胞功能的影響。結(jié)果試驗發(fā)現(xiàn)：大青葉水煎劑對小鼠脾淋巴細胞的增殖反應具有上調(diào)作用，同時大青葉與刀豆素 A（ ConA）和細菌脂多糖（ LPS）協(xié)同對小鼠脾淋巴細胞增殖活性有促進作用，并且能促進小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，推斷大青葉的抗炎、抗病毒作用可能不是直接抑菌、殺菌，而在于調(diào)動機體內(nèi)的其他抗 感染功能 [18]。趙紅等 [19]通過 3H— TdR摻入法測定不同深度大青葉水煎劑對小鼠脾淋巴細胞和腹腔巨噬細胞的毒性作用，用 MTT 方法 TNF 的敏感細胞株 L929．白細胞介素 IL2 的依賴株 (CTLL2)分別檢測 IL TNF 的生物學活性。結(jié)果表明大青葉水煎劑在～ ，能促進正常小鼠被 ConA 誘導的脾淋巴細胞分泌 IL2，但對小鼠腹腔巨噬細胞分泌 TNFa 無明顯作用．認為大青葉水煎劑通過促進淋巴細胞 IL2 的分泌可以上調(diào)小鼠免疫功能，同時對巨噬細胞分泌 TNF 致炎效應和免疫病理損傷無明顯 影響。 國外學者實驗證明蓼大青具有很好的抗過敏活性，它能夠抑制化合物 48/80和抗二硝基苯 IgE 抗體引起的肥大細胞的過敏性反應 [20]。另有實驗表明：蓼大青的醋酸乙酯萃取部分能夠顯著地抑制 NO的合成，其途徑是通過小鼠腹膜的巨噬細胞誘導干擾素 γ 脂多糖，且這種抑制作用隨藥物的增加而增大，該研究結(jié)果表明蓼大青的萃取物可能對涉及 NO合成的多種疾病具有潛在的治療和調(diào)節(jié)作用 [21]。由于大青葉及其代用品具有抗炎作用，人們針對其有效化學成分靛玉紅進行了研究，發(fā)現(xiàn)靛玉紅不僅可以通過 HBL38 抑制干擾素 γ的生成 ，還可以由脾細胞抑制干擾素 γ和白細胞介素的產(chǎn)生 [22]。大青葉中的另一化學成分色胺酮具有改善由右旋糖苷硫酸鈉誘發(fā)的大腸炎癥的功能。給小鼠飲用 5％的右旋糖苷硫酸鈉水誘發(fā)產(chǎn)生大腸炎癥，同時每日給小鼠 po100mg∕kg色胺酮，組織病理學分析結(jié)果顯示 6d后觀察到服用色胺酮組的大腸的損傷程度較小，而一旦停止用藥，損傷則重新產(chǎn)生；體外實驗表明服用色胺酮的小鼠脾細胞產(chǎn)生的白細胞介素 IL2 和干擾素 γ 的量較少；實驗中服用色胺酮組的小鼠全部滅活，從而證明色胺酮對腸炎具有治療作用 [23]。 抗癌作用：大青葉具有具 有抗腫瘤作用，大青葉中的靛玉紅對動物移殖性腫瘤有較強的抑制作用，對慢性粒細胞白血病有較好的療效。最近人們運用新近發(fā)展的藥理模型證明靛玉紅可能是芳香基型內(nèi)源配體，可以被外源配體激活，調(diào)節(jié)多種酶系統(tǒng)以及參與細胞增殖的調(diào)節(jié)。研究表明靛玉紅很可能通過誘導 MCF7 肺癌細胞中細胞色素 P4501A1 和 1BlmRNA 酶的活性，參與調(diào)節(jié)肺癌細胞的新陳代謝 [24]。另外，趙從凱等用大青葉多糖對小鼠 S180 肉瘤進行作用研究后發(fā)現(xiàn)，大青葉多糖的濃度越高，其抑瘤率越高，說明大青葉多糖在抗癌方面有一定作用。 多糖的提取方法 種類繁多的植物多糖，存在于植物中的不圍不盡相同。一般植物細胞壁比較牢固，在提取前需要進行專門的破細胞操作，包括機械破碎法、溶脹和自脹、化學處理和生物酶降解。因此，植物多糖提取的研究中采用了許多不同的方法，包括溶劑提取、酸提法、堿提法、酶提法、超濾法、微波法等。 大青葉多糖提取工藝研究 3 溶劑提取法 溶劑提取法是從植物中提取多糖的常用方法，溶劑提取法一般應遵循相似相溶的原則。多糖是極性大分子化合物，在所有溶劑中，水、乙醇是典型的強極性溶劑，對植物組織的穿透力強，提取效率高，在生產(chǎn)上使用安全。溶劑提取為常用的傳統(tǒng) 方法之一，有自身的優(yōu)點。如不需特殊設備、成本低等。目前，大青葉多糖大多采取水提醇沉法制備 [25]。 稀酸提取 有些多糖適合用稀酸提取。如茜草多糖的提取研究中，發(fā)現(xiàn)相對于水提，以稀酸提取多糖產(chǎn)品純度較高。但酸提法有其特殊性，只在一些特定的植物多糖提取中占有優(yōu)勢，目前報道的并不多。而且即使有優(yōu)勢，在操作中還應嚴格控制酸度，因為酸性條件下可能引起多糖中的糖苷鍵斷裂。 堿提取 有些多糖在堿液中有更高的提取率，尤其是提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。與酸提類似，堿提取中堿的濃度也應得到有效控制，因為 有些多糖在堿性較強時會水解。 酶提法 酶技術(shù)是近年來廣泛應用的一項生物技術(shù)，在多糖的提取過程中，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件中分解植物組織，加速多糖的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等非目的產(chǎn)物。 超濾法 超濾是一種膜分離技術(shù)，所采用的超濾膜能夠從水和其他液體中分離出很小的膠體和大分子。具有不隨害活性、分離效率高、能耗低、設備簡單、可連續(xù)生產(chǎn)、無污染等優(yōu)點。 微波提取法 微波是頻率介于 300MHz— 300GHz 之間的電磁波，微波提取的原理是微 射線輻射于溶劑并透過細胞壁達到細胞內(nèi)部，由于溶劑及細胞液吸收微波能，細胞內(nèi)部溫度升高，壓力增大，當壓力超過細胞壁的承受能力時，細胞壁破裂，位于細胞內(nèi)部的有效成分從細胞中釋放出來，傳遞轉(zhuǎn)移到溶劑周圍被溶劑溶解。 本課題的研究意義 目前，對板藍根多糖的提取及藥理活性研究較多，但對大青葉中多糖研究較少。大青葉和板藍根作為同一植物的不同部位，化學成分大致相同。但是板藍根價錢高于大青葉。通過中藥系統(tǒng)預實驗，大青葉中也含有多糖成分，提取大青葉多糖為提供新的中獸藥藥源奠定理論基礎(chǔ)。盡管中藥現(xiàn)代化提 取手段層出不窮，但是大部分中藥中多糖成分的提取工藝仍沿用水提醇沉的工藝。新興的提取工藝如超聲波法，酶提取法，微波提取法僅局限于實驗室階段，還未大量應用到工業(yè)生產(chǎn)中。水提醇沉工藝對設備要求簡單，提取溶劑成本低廉，所以從經(jīng)濟成本、穩(wěn)定性等方面考慮，本實驗采用傳統(tǒng)的水提醇沉工藝進行大青葉粗多糖的提取，為今后工業(yè)化生產(chǎn)提供工藝參數(shù)，為進一步藥理活性研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 大青葉多糖提取工藝研究 4 2 正交試驗優(yōu)選大青葉多糖的提取工藝 材料與 方法 實驗材料 大青葉 吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院藥用 植物專業(yè)楊莉博士惠贈 蒸餾水 東北農(nóng)業(yè)大學自制 實驗儀器 電子分析天平 中獸醫(yī)實驗室 電磁爐 美的 電器有限公司 恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 亞榮生化 離心機 上?？茖W儀器廠 電熱鼓風干燥箱 上海實驗儀器總廠 大青葉多糖 提取 稱取 50 g 大青葉，置于燒杯中放于水浴鍋水浴加溫，或者電磁爐中用自來水進行水煮提取，三層紗布過濾， 3000 r低速離心 15 min。取上清液濃縮，向濃縮液中加入乙醇，進行醇沉，得到白色絮狀沉淀。將其靜置 24 h 后，離心過濾，將得到的沉淀至于干燥箱內(nèi)，在 60 ℃ 下進行干燥，所得褐色 粘稠 固體即為粗多糖。將粗糖稱重，計算粗糖的得率。具體方法如下：大青葉粗多糖的得率采用重量法進行測定。具體過程如下：精密稱取所用藥材的重量 (m)，將所得的粗多糖置于已干燥至恒重 的蒸發(fā)皿中 (m0)，置于干燥箱內(nèi)進行干燥，冷卻后，使用千分之一感量得分析天平稱定其質(zhì)量 (mi)，按公式（ mi m0） /m100％，計算大青葉粗多糖的得率。 各因素對多糖提取效果的影響 本文選取與工業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)且容易控制的影響因素：料液比（ m/v)，提取時間，提取次數(shù)，提取溫度做為單因素考察對象。 提取溫度對多糖提取效果的影響 溫度是多糖得率的重要影響因素之一。溫度低，提取不完全，溫度高，導致多糖糊化，分解失活。提取時間 1 h，提取次數(shù) 1 次，料液比 1:15，醇沉比為 1:3，提取溫度分 別為60 ℃ 、 80 ℃ 、 100 ℃ ，考察提取時間對多糖提取效果的影響。 提取時間對多糖提取效果的影響 提取溫度 100 ℃ ，提取次數(shù) 1 次，料液比 1:45，醇沉比為 1:3，提取時間分別為 1 h、2 h、 3 h，考察提取時間對大青葉多糖提取效果的影響。 料液比對多糖提取效果的影響 大青葉是葉類藥材，一粉即碎成細粉，煎煮容易糊鍋，不利于多糖的提取，實驗前簡單敲打破碎，不用中藥粉碎機粉碎，然后煎煮。此時料液比直接影響多糖的提取效果?？刂铺崛囟?100 ℃ ，提取時間 1 h，提取次數(shù) 1 次，醇沉比為 1:3，料液比（ g/mL）分別為 1∶ 1 1∶ 1： 45，考察料液比對多糖提取效果的影響。 大青葉多糖提取工藝研究 5 提取次數(shù)對多糖提取效果的影響 控制提取時間 1 h，提取溫度 100 ℃ ，料液比 1:20，醇沉比為