【正文】 測(cè)定大青葉的各級(jí)提取物 (水提液、乙醇提取液、正丁醇萃取液 )對(duì)金黃色葡萄球菌、腸炎桿菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度 (MIC)，實(shí)驗(yàn)證明各級(jí)提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)菌分別有不同程度的抑菌作用．其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最為明顯。孫立新 [13]等則 以枯草桿菌和短小芽胞桿菌作為大青葉的藥理活性檢測(cè)指標(biāo)。 抗病毒作用：采用大青葉注射液做抗病毒試驗(yàn)，證明其對(duì)甲型流感病毒、乙型腦炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒有抑制感染并有抑制增殖作用 [14]。其血凝滴度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大多數(shù)藥材對(duì)甲型流感病毒有直接作用、治療作用和預(yù)防作用。 抗內(nèi)毒素活性：大青葉性味苦寒，具清熱解毒涼血利咽的功效。劉云海等 [17]采用動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素濃度，觀察大青葉不同化學(xué)部位對(duì)放線菌素 D 敏化小鼠內(nèi)毒素致死攻擊的保護(hù)作用，并以內(nèi)毒素制備家兔發(fā)熱模型，測(cè)定其肛溫變化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大青葉的正丁醇萃取部位能直接 中和降解內(nèi)毒素，顯著降低內(nèi)素的致熱性和致死性，說(shuō)明其具有顯著的體內(nèi)、外抗內(nèi)毒素活性。為了解其在免疫調(diào)節(jié)中的作用，張淑杰等 [18]觀察了大青葉水煎劑對(duì)小鼠免疫細(xì)胞功能的影響。趙紅等 [19]通過(guò) 3H— TdR摻入法測(cè)定不同深度大青葉水煎劑對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞的毒性作用，用 MTT 方法 TNF 的敏感細(xì)胞株 L929．白細(xì)胞介素 IL2 的依賴株 (CTLL2)分別檢測(cè) IL TNF 的生物學(xué)活性。 國(guó)外學(xué)者實(shí)驗(yàn)證明蓼大青具有很好的抗過(guò)敏活性，它能夠抑制化合物 48/80和抗二硝基苯 IgE 抗體引起的肥大細(xì)胞的過(guò)敏性反應(yīng) [20]。由于大青葉及其代用品具有抗炎作用，人們針對(duì)其有效化學(xué)成分靛玉紅進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)靛玉紅不僅可以通過(guò) HBL38 抑制干擾素 γ的生成 ，還可以由脾細(xì)胞抑制干擾素 γ和白細(xì)胞介素的產(chǎn)生 [22]。給小鼠飲用 5％的右旋糖苷硫酸鈉水誘發(fā)產(chǎn)生大腸炎癥，同時(shí)每日給小鼠 po100mg∕kg色胺酮，組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示 6d后觀察到服用色胺酮組的大腸的損傷程度較小，而一旦停止用藥，損傷則重新產(chǎn)生；體外實(shí)驗(yàn)表明服用色胺酮的小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素 IL2 和干擾素 γ 的量較少；實(shí)驗(yàn)中服用色胺酮組的小鼠全部滅活，從而證明色胺酮對(duì)腸炎具有治療作用 [23]。最近人們運(yùn)用新近發(fā)展的藥理模型證明靛玉紅可能是芳香基型內(nèi)源配體，可以被外源配體激活，調(diào)節(jié)多種酶系統(tǒng)以及參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。另外，趙從凱等用大青葉多糖對(duì)小鼠 S180 肉瘤進(jìn)行作用研究后發(fā)現(xiàn)，大青葉多糖的濃度越高，其抑瘤率越高，說(shuō)明大青葉多糖在抗癌方面有一定作用。一般植物細(xì)胞壁比較牢固，在提取前需要進(jìn)行專門(mén)的破細(xì)胞操作，包括機(jī)械破碎法、溶脹和自脹、化學(xué)處理和生物酶降解。 大青葉多糖提取工藝研究 3 溶劑提取法 溶劑提取法是從植物中提取多糖的常用方法，溶劑提取法一般應(yīng)遵循相似相溶的原則。溶劑提取為常用的傳統(tǒng) 方法之一，有自身的優(yōu)點(diǎn)。目前，大青葉多糖大多采取水提醇沉法制備 [25]。如茜草多糖的提取研究中，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于水提，以稀酸提取多糖產(chǎn)品純度較高。而且即使有優(yōu)勢(shì)，在操作中還應(yīng)嚴(yán)格控制酸度，因?yàn)樗嵝詶l件下可能引起多糖中的糖苷鍵斷裂。與酸提類似，堿提取中堿的濃度也應(yīng)得到有效控制，因?yàn)?有些多糖在堿性較強(qiáng)時(shí)會(huì)水解。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等非目的產(chǎn)物。具有不隨害活性、分離效率高、能耗低、設(shè)備簡(jiǎn)單、可連續(xù)生產(chǎn)、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。 本課題的研究意義 目前，對(duì)板藍(lán)根多糖的提取及藥理活性研究較多，但對(duì)大青葉中多糖研究較少。但是板藍(lán)根價(jià)錢(qián)高于大青葉。盡管中藥現(xiàn)代化提 取手段層出不窮，但是大部分中藥中多糖成分的提取工藝仍沿用水提醇沉的工藝。水提醇沉工藝對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，提取溶劑成本低廉，所以從經(jīng)濟(jì)成本、穩(wěn)定性等方面考慮，本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的水提醇沉工藝進(jìn)行大青葉粗多糖的提取，為今后工業(yè)化生產(chǎn)提供工藝參數(shù)，為進(jìn)一步藥理活性研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。取上清液濃縮，向濃縮液中加入乙醇，進(jìn)行醇沉，得到白色絮狀沉淀。將粗糖稱重，計(jì)算粗糖的得率。具體過(guò)程如下：精密稱取所用藥材的重量 (m)，將所得的粗多糖置于已干燥至恒重 的蒸發(fā)皿中 (m0)，置于干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥，冷卻后，使用千分之一感量得分析天平稱定其質(zhì)量 (mi)，按公式（ mi m0） /m100％，計(jì)算大青葉粗多糖的得率。 提取溫度對(duì)多糖提取效果的影響 溫度是多糖得率的重要影響因素之一。提取時(shí)間 1 h，提取次數(shù) 1 次，料液比 1:15，醇沉比為 1:3，提取溫度分 別為60 ℃ 、 80 ℃ 、 100 ℃ ，考察提取時(shí)間對(duì)多糖提取效果的影響。 料液比對(duì)多糖提取效果的影響 大青葉是葉類藥材，一粉即碎成細(xì)粉，煎煮容易糊鍋，不利于多糖的提取，實(shí)驗(yàn)前簡(jiǎn)單敲打破碎，不用中藥粉碎機(jī)粉碎，然后煎煮?？刂铺崛囟?100 ℃ ，提取時(shí)間 1 h，提取次數(shù) 1 次，醇沉比為 1:3，料液比（ g/mL）分別為 1∶ 1 1∶ 1： 45，考察料液比對(duì)多糖提取效果的影響。 數(shù)據(jù)處理方法 經(jīng)過(guò)不同 單因素考察 后的數(shù)據(jù)用 Excel2021 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理、作 折線 圖 ，繪制趨勢(shì)圖 。 正交試驗(yàn)優(yōu)選大青葉中大青葉多糖水 提 醇沉工藝 研究 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選取：提取溫度（ A）、提取時(shí)間（ B）、 料液比 （ C）、提取次數(shù)（ D）四個(gè)因素進(jìn)行 4 因素 3 水平正交實(shí)驗(yàn)，選用 L9（ 34）正交表，因素水平安排見(jiàn)表 1。并且是決定成本的一個(gè)重要因素。故正交設(shè)計(jì)時(shí)選擇提取溫度的水平為 85 ℃、 90 ℃、 100 ℃。而多糖得率則隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)而下降。故正交設(shè)計(jì)時(shí) 選擇提取時(shí)間的水平為 h、 h、 h。實(shí)際應(yīng)用中料液比過(guò)小不利于浸透提取，過(guò)大又不利于濃縮和醇沉的操作，因此正交設(shè)計(jì)選取水平點(diǎn)設(shè)計(jì)為 1:15,1:25,1:35。 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)大青葉粗多糖的影響 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)大青葉粗多糖的影響見(jiàn)表 2。 分析表中數(shù)據(jù)可見(jiàn)，僅影響因素 料液比和提取次數(shù) 對(duì)大青粗糖得率影響達(dá)到顯著地步。 大青葉多糖提取工藝研究 9 表 3 大青葉粗糖提取工藝方差分析表 變異來(lái)源 平方和 自由度 F 值 p 值 A 2 B 2 C 2 D 2 誤差 18 表 4 大青葉粗糖提取工藝多重比較結(jié)果 影響因子 處理 均值 5%顯著水平 1%極顯著水平 C 3 a A 2 a AB 1 b B D 2 a A 3 a A 1 b B 由表可見(jiàn)， 最優(yōu)提取條件 為 A1B1C2D2， 85℃ 提取溫度 ,25:1 的料液比 ,提取 h,提取 2次 ,為粗糖最優(yōu)工藝 . 最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 取 100 克大青葉藥材 ,按照 項(xiàng)下最優(yōu)工藝 85℃ 提取溫度 ,25:1 的料液比 ,提取一小時(shí) ,提取 2 次 , 水浴加溫 .提取三次 ,三次粗糖得率分別為 %， %， %。 大青葉多糖提取工藝研究 10 4 討論 迄今為止，菘藍(lán)的多糖主要從板藍(lán)根中提取，大青葉中提取板藍(lán)根多糖研究較少?；瘜W(xué)成分上看，已有的研究表明大青葉生物堿，有機(jī)酸含量較高，板藍(lán)根氨基酸以及胞苷腺苷等成分較高。 本研究通過(guò)得出的最優(yōu)工藝，提取粗多糖的含量與張明 [27]等研究相比略低，評(píng)價(jià)指標(biāo)一致，都是重量法計(jì)算粗多糖的提取率，張氏用復(fù)合酶水解法提取大青葉粗多糖，提取溫度更低，多糖的的得率也比較高。傳統(tǒng)方法一直在生產(chǎn) 一線使用，本研究更具實(shí)際意義。 5 結(jié)論 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究 ,大青葉多糖水提醇沉方法的最優(yōu)提取工藝為 :85℃ 提取溫度 ,25:1的液料比 ,提取 h,提取 2 次。該工藝在實(shí)驗(yàn)室條件下較為穩(wěn)定。 2021. 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