第六節(jié)植物克隆載體-閱讀頁(yè)
2024-10-19 15:39本頁(yè)面
【正文】 80140 痘病毒 300 200 100 dsDNA 240300 逆病毒 MLV,MSV 100120 ssRNA 二 . 病毒型載體 1. 特點(diǎn) 1) 可在動(dòng)物細(xì)胞中形成病毒顆粒（形態(tài)構(gòu)成組分來(lái)自天然病毒或原病毒細(xì)胞） 2) DNA轉(zhuǎn)移效率高，但必須與天然 (輔助 )病毒共感染動(dòng)物細(xì)胞 3) 大多數(shù)被感染動(dòng)物細(xì)胞將是致死的，但有少數(shù)病毒（如逆病毒）載體可穩(wěn)定整合到染色體 DNA中。 2） 非復(fù)制型 ：這類載體是在細(xì)菌克隆載體中插入一段病毒 DNA（不含復(fù)制起點(diǎn)）。這類載體特別適合于那些較大的病毒 DNA分子。 2. 組成 ： pMB1和病毒復(fù)制起點(diǎn)（如 SV40， BPV， EBV等），適合于細(xì)菌和動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。其中 T抗原參與 SV40的有效感染，并能特異地結(jié)合在病毒 DNA復(fù)制起點(diǎn)上，這種結(jié)合對(duì) DNA復(fù)制是必須的。 當(dāng)含 SV40復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒型載體或重組 DNA分子轉(zhuǎn)入 COS細(xì)胞后 (含有 SV40的 T抗原 )可大量復(fù)制 , 其拷貝數(shù)可達(dá) 2040萬(wàn)。由 69T和 。 1. 逆病毒克隆載體 1) 逆病毒用于載體的優(yōu)點(diǎn) : i. 基因組小 , 易于操作 ii. 高滴度 , 易于導(dǎo)入細(xì)胞 iii. 準(zhǔn)確整合入受體細(xì)胞染色體中 , 外源基因可穩(wěn)定表達(dá)，具有 強(qiáng)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子 , 可在多種細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因 2) 逆病毒載體的用途 i. 基因治療 ii. 在胚胎組織中研究特定基因的發(fā)育功能 iii. 可用作家系標(biāo)記 iv. 導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞 , 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 v. 用作插入突變劑 vi. 用于逆病毒分子生物學(xué)研究 3) 逆病毒的生活史和基因組結(jié)構(gòu) 生活史 : 病毒粒子感染 反轉(zhuǎn)錄為線狀 dsDNA 整合到染色體中轉(zhuǎn)錄為 2個(gè) mRNA分子 翻譯成病毒蛋白 包裝成病毒粒子 釋放到細(xì)胞外 結(jié)構(gòu) : i. 長(zhǎng)末端重復(fù) (long terminal repeat, LTR) ii. 正鏈和反鏈引物序列 PB(), PB(+) iii. 包裝序列 Ψ(gag基因編碼區(qū) 5’端 420 bp序列 ) iv. 反式作用基因 : gag—核心蛋白 。 env外殼糖蛋白 v. RNA剪接供體和受體序列 SD, SA 4) 逆病毒的宿主范圍 i. 種特異性 窄譜 (ecotrophic): 如 MMLV僅限于鼠細(xì)胞；廣譜 (amphotropic): 如 MLV在鳥(niǎo)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 , 用 MMLV所構(gòu)建的載體也可具廣譜性 , 只要用廣譜逆病毒的外殼蛋白包裝即可 ii. 組織特異性 成纖維細(xì)胞 , 淋巴細(xì)胞 , 上皮細(xì)胞 iii. 免疫性 5) 逆病毒克隆載體 i. 單基因載體 僅保留逆病毒的 LTR序列 , 無(wú)標(biāo)記基因 ii. 雙基因載體 : 剪接載體 。 雙順?lè)醋虞d體 。 在 雙順?lè)醋虞d體中 , 兩基因共用一個(gè)基因啟動(dòng)子 , 但有各自的翻譯起始區(qū) 。539。539。若培養(yǎng)基中不加入鳥(niǎo)嘌呤而改用黃嘌呤則此細(xì)胞不能生長(zhǎng)，但轉(zhuǎn)化性細(xì)胞則能在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
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