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第六節(jié)植物克隆載體-文庫(kù)吧資料

2024-10-13 15:39本頁(yè)面
  

【正文】 AΨ PB()RU5 U3 R g a g p o l e n v Ψ AAAA 339。 在 剪接載體 中 , 逆病毒的 LTR序列和剪接位點(diǎn)保留 , 兩基因共用一個(gè)啟動(dòng)子和翻譯起始區(qū) 。 內(nèi)啟動(dòng)子載體 。 pol—反轉(zhuǎn)錄酶 /整合酶 。 BPV1( 7 9 5 6 b p )L1L2E1E269THBpBPVtk( 1 1 . 6 k b )BPV質(zhì)粒載體 三 . 整合型載體 這類(lèi)載體可借助同源重組作用使外源基因插入染色體或病毒基因組中。 SV 4 0T 抗原t 抗原VP2VP3VP1ORB Ep34 2 E( 4 . 9 k b )H B S A gAprSV40質(zhì)粒載體 2) BPV1質(zhì)粒載體 BPV1中 69T是轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞所必需的 , 約占該病毒 DNA總長(zhǎng)的 69%, 單向轉(zhuǎn)錄。因復(fù)制起點(diǎn)與該基因的啟動(dòng)子順序相近,故它本身的表達(dá)也受到 T抗原的控制。 3. 實(shí)例 1) SV40質(zhì)粒載體 SV40具如下物理圖譜, 5243bp, 為兩種抗原( T和 t抗原)和三種病毒衣殼蛋白編碼。 實(shí)例 :痘病毒長(zhǎng) 180kb,編碼 150多種多肽,整個(gè)生存階段均在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),它能合成 DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾的各種酶類(lèi),由此病毒構(gòu)建的非復(fù)制型載體就是在細(xì)菌載體中插入一段痘病毒 DNA. 三 . 質(zhì)粒型載體 1. 特點(diǎn) : 不能形成病毒顆粒,以高拷貝質(zhì)粒形式存在于動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),不導(dǎo)致動(dòng)物細(xì)胞死亡。當(dāng)外源 DNA插入該載體后,與相應(yīng)的天然病毒一起感染動(dòng)物細(xì)胞,外源 DNA可借助兩病毒 DNA同源部分的重組插入天然病毒。 4) 插入病毒載體的外源基因只能在動(dòng)物細(xì)胞中作瞬時(shí)表達(dá) 2. 載體種類(lèi) 根據(jù)構(gòu)建載體的病毒基因大小可分為兩類(lèi): 1) 復(fù)制型 :由小分子病毒 DNA 構(gòu)建而成,具復(fù)制起點(diǎn),其克隆位點(diǎn)可在病毒 DNA之內(nèi),亦可在病毒 DNA之外,這類(lèi)載體有的容量十分有限(如 SV40),有的則很大(如HSV),其容量大小主要取決于病毒外殼蛋白的包裝能力。 3)高拷貝,外源基因高效表達(dá)。 2. RNA病毒載體 BMV(雀麥花葉病毒)和 TMV載體優(yōu)點(diǎn): 1)轉(zhuǎn)化頻率高 。轉(zhuǎn)移過(guò)程: pBIN19 TDNA進(jìn)入植物細(xì)胞 該系統(tǒng)的最終轉(zhuǎn)化頻率比 SEV系統(tǒng)高得多 3) 標(biāo)記基因 生化標(biāo)記基因 :冠癭堿合成酶基因( NOS, OCS) lacZ, CAT, 熒光酶基因, GUS 藥物抗性標(biāo)記基因 :除草劑耐受性基因, CHMTⅡ (金屬巰蛋白基因), Bleomycin, Hgyr, SPT, DHFR, NPTⅡ (Kanr, G418r) 標(biāo)記基因常用的啟動(dòng)子有 CaMV 35S,OCS,NOS等。 iii)雙末端載體 (binary vector) 該類(lèi)載體的顯著特點(diǎn)是含有兩個(gè) TDNA末端,所有需要轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中去的序列都位于其間。 5 7 i a a H i a a M i p t 6 a 6 b OCSNOSacs 魚(yú)堿型T D N A胭脂堿型T D N ATi質(zhì)粒的 TDNA的同源性 2. Ti質(zhì)粒載體 1) Ti質(zhì)粒作為載體的問(wèn)題 i) 太大,無(wú)適合克隆位點(diǎn) ii)T
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