第六節(jié)植物克隆載體(已改無錯(cuò)字)
2022-10-28 15:39:02 本頁面
【正文】 起點(diǎn)與該基因的啟動(dòng)子順序相近，故它本身的表達(dá)也受到 T抗原的控制。 當(dāng)含 SV40復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒型載體或重組 DNA分子轉(zhuǎn)入 COS細(xì)胞后 (含有 SV40的 T抗原 )可大量復(fù)制 , 其拷貝數(shù)可達(dá) 2040萬。 SV 4 0T 抗原t 抗原VP2VP3VP1ORB Ep34 2 E( 4 . 9 k b )H B S A gAprSV40質(zhì)粒載體 2) BPV1質(zhì)粒載體 BPV1中 69T是轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞所必需的 , 約占該病毒 DNA總長(zhǎng)的 69%, 單向轉(zhuǎn)錄。由 69T和 。 BPV1( 7 9 5 6 b p )L1L2E1E269THBpBPVtk( 1 1 . 6 k b )BPV質(zhì)粒載體 三 . 整合型載體 這類載體可借助同源重組作用使外源基因插入染色體或病毒基因組中。 1. 逆病毒克隆載體 1) 逆病毒用于載體的優(yōu)點(diǎn) : i. 基因組小 , 易于操作 ii. 高滴度 , 易于導(dǎo)入細(xì)胞 iii. 準(zhǔn)確整合入受體細(xì)胞染色體中 , 外源基因可穩(wěn)定表達(dá)，具有 強(qiáng)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子 , 可在多種細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因 2) 逆病毒載體的用途 i. 基因治療 ii. 在胚胎組織中研究特定基因的發(fā)育功能 iii. 可用作家系標(biāo)記 iv. 導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞 , 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 v. 用作插入突變劑 vi. 用于逆病毒分子生物學(xué)研究 3) 逆病毒的生活史和基因組結(jié)構(gòu) 生活史 : 病毒粒子感染 反轉(zhuǎn)錄為線狀 dsDNA 整合到染色體中轉(zhuǎn)錄為 2個(gè) mRNA分子 翻譯成病毒蛋白 包裝成病毒粒子 釋放到細(xì)胞外 結(jié)構(gòu) : i. 長(zhǎng)末端重復(fù) (long terminal repeat, LTR) ii. 正鏈和反鏈引物序列 PB(), PB(+) iii. 包裝序列 Ψ(gag基因編碼區(qū) 5’端 420 bp序列 ) iv. 反式作用基因 : gag—核心蛋白 。 pol—反轉(zhuǎn)錄酶 /整合酶 。 env外殼糖蛋白 v. RNA剪接供體和受體序列 SD, SA 4) 逆病毒的宿主范圍 i. 種特異性 窄譜 (ecotrophic): 如 MMLV僅限于鼠細(xì)胞；廣譜 (amphotropic): 如 MLV在鳥和哺乳動(dòng)物細(xì)胞 , 用 MMLV所構(gòu)建的載體也可具廣譜性 , 只要用廣譜逆病毒的外殼蛋白包裝即可 ii. 組織特異性 成纖維細(xì)胞 , 淋巴細(xì)胞 , 上皮細(xì)胞 iii. 免疫性 5) 逆病毒克隆載體 i. 單基因載體 僅保留逆病毒的 LTR序列 , 無標(biāo)記基因 ii. 雙基因載體 : 剪接載體 。 內(nèi)啟動(dòng)子載體 。 雙順反子載體 。 在 剪接載體 中 , 逆病毒的 LTR序列和剪接位點(diǎn)保留 , 兩基因共用一個(gè)啟動(dòng)子和翻譯起始區(qū) 。 在 雙順反子載體中 , 兩基因共用一個(gè)基因啟動(dòng)子 , 但有各自的翻譯起始區(qū) 。 在 內(nèi)啟動(dòng)子載體 中 , 兩基因各有自己的啟動(dòng)子 iii. 自失活載體 (selfinactivation vector) iv. 自主復(fù)制載體 (replicationpetent vector) 2. 痘病毒克隆載體
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