【正文】 酸殘基構(gòu)成。結(jié)構(gòu)域常具特殊功能，例如，結(jié)合小分子 (3磷酸甘油醛脫氫酶同 NAD的結(jié)合屬于這種情況 )（圖 230） 。 ▲ 離子相互作用 ： 蛋白質(zhì)分子的相反電荷基團(tuán)的結(jié)合稱為鹽鍵或離子鍵 (離子對 ) （圖 231） 。 蛋白質(zhì)具有眾多的氫鍵供體和受體，包括主鏈上的羰基和酰胺基及極性側(cè)鏈基團(tuán)。 這種力產(chǎn)生于永久的或誘導(dǎo)的偶極之間的靜電相互作用。 ▲ 疏水作用 : 疏水作用是由于蛋白質(zhì)多肽鏈的疏水殘基具有避開水的傾向、彼此在分子內(nèi)聚集所產(chǎn)生的作用力 （圖 233） 。 ▲ 二硫鍵 : 二硫鍵是某些蛋白質(zhì)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要因素，由兩個 Cys的側(cè)鏈 SH氧化而成 （圖 231） 。 在寡聚蛋白質(zhì)中，每一條折疊的多肽鏈稱為 亞基 (subunit), 亞基可相同也可不同，取決于寡聚蛋白質(zhì)的亞基組成。在寡聚蛋白質(zhì)中，穩(wěn)定亞基間相互關(guān)系的作用力與維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的作用力相同，即 亞基間的離子鍵、氫鍵和疏水作用力。原體可由一條肽鏈 (一個亞基 )構(gòu)成 ,也可以由幾條不同的肽鏈 (幾個不同的亞基 )構(gòu)成 .例如血紅蛋白是由二個 α 亞基和二個β 亞基構(gòu)成的四聚體 (α 2β 2)。在這個意義上說，血紅蛋白是由二個原體構(gòu)成的一種二聚體。 但是，蛋白質(zhì)不可能倒置或鏡像對稱，因?yàn)檫@樣一種對稱結(jié)合把手性 L殘基轉(zhuǎn)變成 D殘基。 3. 亞基組成測定 4. 寡聚體蛋白質(zhì)存在的意義 ? 增高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 . 亞基結(jié)合的一個普遍性的好處是有利于減少蛋白質(zhì)表面積 /體積比。 因?yàn)閷τ谇蛐挝矬w來說，表面積是半徑平方的函數(shù)，體積是半徑立方的函數(shù)： 表面積 ＝ 4πr2；體積 ＝ 4/3πr3；表面積 /體積 ＝ 3/上是有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定 , 由于蛋白質(zhì)表面與溶劑水的相互作用往往在能量上是不利的， 因此在通常的情況下， 減少表面積 /體積的比例將會使蛋白質(zhì)變得更加穩(wěn)定。 編碼一個能裝配成同聚多體的單體所需要的 DNA片段比編碼一條與該同聚多肽具同樣分子量的大多肽所需的 DNA片段小許多。 例如HIV(人類免疫缺陷性病毒 )蛋白酶 是由相同亞基構(gòu)成的一種二聚體蛋白質(zhì)，它履行與同源細(xì)胞的酶相似的功能 (即都能催化蛋白質(zhì)的水解 )，但是 HIV蛋白酶的分子量只是那些由單一肽鏈構(gòu)成的酶的一半。這方面的相關(guān)例子在后續(xù)有關(guān)章節(jié)中將會涉及到。單體也許不能構(gòu)成完整的活性部位，寡聚體的形成可能使所有必需的催化基團(tuán)匯聚形成酶的活性部位。 ? 寡聚體酶的不同亞基也許執(zhí)行不同但相關(guān)連的反應(yīng)。 五、蛋白質(zhì)的變性 (denaturation) 天然蛋白質(zhì)在構(gòu)象上的亞穩(wěn)定性的，很容易受到許多不利因素的影響而破壞其結(jié)構(gòu)。表明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)只要有任何局部的破壞，都將導(dǎo)致整個結(jié)構(gòu)的瓦解 。 六．蛋白質(zhì)的氨基酸順序與空間構(gòu)象的關(guān)系 決定蛋白質(zhì)三維構(gòu)象的信息存在于它們的特定的氨基酸順序中。只有當(dāng)酶重新把 SH安置在正確的配對位置才能予以解釋 （圖235） 。 該實(shí)驗(yàn)證明了 蛋白質(zhì)的特定的空間構(gòu)象是由它的一級結(jié)構(gòu)即氨基酸順序決定的。 、順序與空間構(gòu)象的關(guān)系 Leu 、 Met 、 Glu 、 Ala是 α螺旋的強(qiáng)形成者； Ieu、 Val、 Phe、Tyr是 β螺旋的強(qiáng)形成者； Pro、 Gly是 α螺旋的強(qiáng)破壞者； Pro也不適合于 β片。此外在 Cβ位有分枝的殘基 (例如 Ile,Thr) 連續(xù)出現(xiàn)則使 α螺旋失去穩(wěn)定 （表 21） 。 主要功能 是通過動脈和靜脈循環(huán)著的血液在肺部和毛細(xì)血管間轉(zhuǎn)運(yùn)氧。肌紅蛋白是組織細(xì)胞內(nèi)的氧貯存者。 血紅蛋白和肌紅蛋白對氧親和力的差別導(dǎo)致一種有效的氧釋放系統(tǒng)的產(chǎn)生，該差別是由它們的分子結(jié)構(gòu)不同所致。含有一個 血紅素 (heme)輔基，它被包埋于 E螺旋和 F螺旋的孔穴內(nèi)。 卟啉環(huán)結(jié)合的 Fe在正常下保持亞鐵離子狀態(tài)。 血紅蛋白的 α亞基和 β亞基在結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上彼此相關(guān)，也與肌紅蛋白相關(guān)。 這兩個亞基在一級結(jié)構(gòu)上與肌紅蛋白具有部分順序同源性。 1．兩者的氧合曲線是不同的： 肌紅蛋白的氧合曲線是雙曲線，而血紅蛋白的氧合曲線是 S型曲線 （圖 240） 。 這就是說，一個小分子的結(jié)合影響其余小分子的結(jié)合。這與肌紅蛋白分子只有一個氧結(jié)合部位不同。 氧 合作用對血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生廣泛的影響，即 氧 合和脫氧血紅蛋白有不同的結(jié)構(gòu)形式。 別構(gòu)作用是寡聚體蛋白質(zhì)在行使功能時的一個共同的特征。 2．協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制 ? Fe2＋ 移入到卟啉環(huán)平面內(nèi)觸發(fā)了 T態(tài)向 R態(tài)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變 （圖 241） ? T態(tài)由鹽鍵和氫鍵網(wǎng)穩(wěn)定，必須打斷才能形成 R態(tài) (圖 242) ? T→ R的轉(zhuǎn)換是由形成 FeO2鍵的能量推動的。目前常使用的分離純化的方法或技術(shù)都是在了解蛋白質(zhì)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上建立的。有些目標(biāo)蛋白質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)的含量很低，這無疑將增加獲取足量蛋白質(zhì)的難度。用于研究目的蛋白質(zhì)通常應(yīng)保持它的生物活性。 一、蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì) 根據(jù)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，很容易得出構(gòu)成蛋白質(zhì)的兩性解離的基礎(chǔ)是氨基酸殘基的側(cè)鏈可解離的基團(tuán)。 所有的蛋白質(zhì)，不管它具有什么樣的功能，都能在細(xì)胞內(nèi)起一定的緩沖作用。 用于蛋白質(zhì)分離的凝膠主要是聚丙烯酰胺凝膠，該凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺配制而成，其最大的特點(diǎn)是凝膠的孔徑可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。 ● 非變性電泳： 蛋白質(zhì)樣品未進(jìn)行變性處理，凝膠中沒加入變性劑，通過電泳分離的蛋白質(zhì)仍具有生物活性 （圖 243） 。這樣，大小不同的肽鏈具有相同的電荷，可根據(jù)蛋白質(zhì)多肽鏈的大小使其分離，常用來測定蛋白質(zhì)亞基的大小和鑒定蛋白質(zhì)的純度 （圖 244） 。 ● 電泳后的蛋白質(zhì)檢測： ◎ 考馬斯亮藍(lán)染色 是常用的一項(xiàng)電泳染色方法 ,是根據(jù)考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)多肽鏈定量結(jié)合的原理而建立起的。 ◎ 活性染色 是根據(jù)有活性的目標(biāo)蛋白質(zhì)特有的生物化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的有色物質(zhì)或另外加入某種能與產(chǎn)物生成顏色的物質(zhì)來進(jìn)行檢測的 .活性染色可以從一個復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品中檢測到目標(biāo)蛋白出現(xiàn)的位置 (圖243).活性染色法在同工酶 (例如酯酶同工酶、谷氨酸脫氫酶同工酶、谷氨酰胺合成酶同工酶等 )的檢測中非常有用。一種蛋白質(zhì) (抗原 )能與它產(chǎn)生的抗體專一地反應(yīng)。 用于蛋白質(zhì)分離純化的離子交換劑多為纖維素離子交換劑。鹽類的存在可降低離子交換劑的離子基團(tuán)和蛋白質(zhì)相反電荷基團(tuán)之間的靜電吸引。同離子交換劑結(jié)合力最小的蛋白質(zhì)首先從層析柱上洗脫下來 （ 圖 247） 。 弱堿性的陰離子交換劑一般適合于分離 pI＜ 。 細(xì)胞原生質(zhì)的主要成分是蛋白質(zhì) ， 原生質(zhì)的膠體狀態(tài)主要是由蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)所造成的 。 任何物質(zhì)的溶解度都取決于溶質(zhì)分子間的相對親和力及溶質(zhì)分子與溶劑分子的相對親和力。 鹽析現(xiàn)象： 隨著鹽濃度的繼續(xù)升高，例如，達(dá)到飽和和半飽和的程度，蛋白質(zhì)的溶解度逐漸變小，彼此之間相互凝聚而發(fā)生沉淀，此現(xiàn)象稱作 鹽析 (sattingout) 。 沉降速度法 ，適用于分離沉降系數(shù)不同但密度相近的蛋白質(zhì)。 沉降系數(shù)： 當(dāng)沉降界面以恒定的速度移動時，單位離心場里的沉降速度。 常用的有葡聚糖凝膠 (sephadex,)或瓊脂糖凝膠(sepharose) 作為層析柱的填充物 。假如某蛋白質(zhì) A，在表現(xiàn)功能的過程中需要和 B物質(zhì)結(jié)合，且結(jié)合是特異的： A + B＝ AA，不能與 B結(jié)合的雜蛋白將從柱下流出 , 然后用適當(dāng)?shù)南疵撘簩?A洗脫下來。為什么會有二種不同的結(jié)果？你認(rèn)為哪種方法更準(zhǔn)確？ 2. 從下面的信息確定某一蛋白質(zhì)亞基組成： 1). 用凝膠過濾法，測定其分子量為 200kD， 2). 用 SDSPAGE，測定其分子量為 100kD， 3). 在巰基乙醇存在下，用 SDSPAGE分析，獲得的分子量 為 60kD和 40kD. 3. 1). 是 Trp還是 Gln更有可能出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的表面？ 2). 是 Ser還是 Val更少可能出現(xiàn)在蛋白質(zhì)的內(nèi)部？ 3). 是 Leu還是 Ile更少可能在 αLelix的中間部位找到？ 4). 是 Cys還是 Ser更有可能出現(xiàn)在 βSheet中？ 4. 在生理?xiàng)l件下，多聚賴氨酸呈隨機(jī)卷曲的構(gòu)象，在什么樣 的條件下，它可以形成 αhelix？ Chapter 3. 酶 (Enzyme) Section 1 酶 的 基 本 性 質(zhì) 一、酶是生物催化劑 酶是生物細(xì)胞產(chǎn)生的、以蛋白質(zhì)為主要成分的、能加快化學(xué)反應(yīng)速度、使之迅速達(dá)到平衡、但不改變反應(yīng)的平衡常數(shù)的生物催化劑。 二、酶能快細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速度 按照能量學(xué)的觀點(diǎn) ,一個化學(xué)反應(yīng)并不是從反應(yīng)物直接向產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行的。只有當(dāng)反應(yīng)物在空間定向上有利于反應(yīng)以及反應(yīng)物達(dá)到轉(zhuǎn)換態(tài)所需的能量（即是否處在化學(xué)鍵的斷裂或形成所需的范圍內(nèi)）時，反應(yīng)才能發(fā)生。 如 圖 3—1所示 ,反應(yīng)物從基態(tài)轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)換態(tài)的能量差值稱為活化能 (△ G?)。 根據(jù)轉(zhuǎn)換態(tài)的理論，一種催化劑的作用在于以某種途徑降低反應(yīng)的活化能而增高化學(xué)反應(yīng)速度。典型的酶促反應(yīng)速度比無催化劑存在的反應(yīng)要高出 106～ 1012倍。 催化劑的功能是增高反應(yīng)的速度，而不會改變反應(yīng)的平衡。在反應(yīng)中，酶不會被消耗，平衡點(diǎn)不會改變，但達(dá)到平衡的速度則要快得多。 四、酶的催化反應(yīng)具有專一性 酶對所催化的底物具有不同程度的選擇性。一般無機(jī)催化劑對它們所作用的底物沒有這種嚴(yán)格的選擇性。 輔助因子 分 輔酶和輔基 (coenzyme amp。 、結(jié)合部位和催化部位 酶的活性中心通常是指酶分子上直接與底物結(jié)合并與催化作用直接有關(guān)的部位，是由酶分子上的某些氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)共同構(gòu)成。 兩者對酶活性都是必須的，前者決定酶的專一性，后者決定酶的催化能力。這些 具有催化活性的 RNA，叫做 Ribozyme，意即酶活性 RNA。， 在體外， 單獨(dú)的蛋白質(zhì)組分不能催化 tRNA前體轉(zhuǎn)變成 tRNA，而 RNA組分在適當(dāng)?shù)臈l件下能完成這種轉(zhuǎn)變反應(yīng)。該過程需要鳥苷或者鳥苷酸的存在 .在體內(nèi)，這種剪接方式可能只進(jìn)行一次， 但在體外， 他象一種真正的酶一樣能作用多次。催化這一反應(yīng)的酶叫做肽基轉(zhuǎn)移酶。催化抗體 (catalytic antibodies)又叫做抗體酶 (abzymes)。 推理是： 一種能專一同某反應(yīng)的轉(zhuǎn)換態(tài)中間物結(jié)合的蛋白質(zhì)，必定能啟動正常反應(yīng)物進(jìn)入到活潑的轉(zhuǎn)換態(tài)構(gòu)象。常規(guī)酶最顯著的催化效力是因?yàn)樗鼈儗λ呋姆磻?yīng)轉(zhuǎn)換態(tài)中間物有很高的親和力，因而抗體酶同它的專一性底物（抗原）必定有很高親和力。例如：乙醇： NAD+脫氫酶 . 2).不管催化正反應(yīng)還是逆反應(yīng)，一般都用同一名稱。 例如： L谷氨脫氫酶催化的反應(yīng)是： （圖 33） 谷氨酸： NAD+脫氫酶 (脫氨 )。2H + B → A + B (transferanses)： 催化功能基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)： AB + C ←→A + BC (hydrolases): 催化水解反應(yīng) :AB + HOH →AOH + BH (lyases)： 催化底物裂解反應(yīng)，并產(chǎn)生雙鍵，或其 逆反應(yīng)，將一個基團(tuán)加到雙鍵上： A (連接酶 )類 (ligases)： 這類酶催化一切必須與 ATP分解相聯(lián)，并由二種物質(zhì)合成一種物質(zhì)的反應(yīng)： A + B + ATP → A 2. 酶的活力單位 . 國際酶學(xué)委員會規(guī)定 , 一個酶活力單位 (unit,u) 是指在 25℃下 , 其它條件如 pH及底物濃度均采用最適條件 , 在 1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1μ mol底物的酶量 (或轉(zhuǎn)化 1μ mol底物的有關(guān)基團(tuán)的酶量 ).但是，酶的活力單位常根據(jù)實(shí)際需要來規(guī)定。 酶的純度是用比活力表示的 ： 比活力 = 活力單位數(shù) /mg蛋白 = 總活力單位數(shù) /總 mg蛋白 . 例如 , 某酶經(jīng)過四個純化步驟后 , 獲得如下的數(shù)據(jù) : 純化步驟： Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 總活力： 6 4 3 2 總蛋白： 20 10 5 2 比活力： 6/20 4/10 3/5 2/2 在提純中，總活性在減少，總蛋白也在減少，但比活性在提高。由于酶的最基本特性就是加快生物化學(xué)反應(yīng)速度，因此，所有酶的催化反應(yīng)速度以及它們的催化效率都是可以定量的。 1. 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響 . 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響如 圖 37所示。他發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖的濃度比酶的濃度高許多時，反應(yīng)速度不再取決于蔗糖的濃度，即是說，反應(yīng)速度相對于蔗糖來說是零級反應(yīng)。 中間產(chǎn)物學(xué)說認(rèn)為 , 當(dāng)酶催化某個反應(yīng)時 , 酶和底物先結(jié)合形成一個中間復(fù)合物 , 然后中間復(fù)合物再分解 , 生成產(chǎn)物并釋