【正文】 重新形成它的正確的二硫鍵，并恢復(fù)酶的活性。 Section 5 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 一、 血紅蛋白與肌紅蛋白的功能比較 血紅蛋白 是血液中紅細(xì)胞的主要蛋白質(zhì)。血紅素是含鐵的原卟啉。 S形的 結(jié)合曲線是一種蛋白質(zhì)的小分子結(jié)合部位之間協(xié)同作用的標(biāo)志。血紅蛋白與 氧 結(jié)合時(shí)的協(xié)同效應(yīng)是別構(gòu)作用的結(jié)果 。因此，在目標(biāo)蛋白質(zhì)的整個(gè)分離純化過程中要在較低溫度下 (0－ 4℃) 操作，注意使用蛋白酶 (使蛋白質(zhì)降解的酶 )的抑制劑，避免使用劇烈條件，以免蛋白質(zhì)特定的折疊結(jié)構(gòu)受到破壞。 ● 變性電泳： SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDSPolyacrylamide Gel Electrophoresis,SDSPAGE)， SDS是一種帶負(fù)電荷的陰離子去垢劑，分子式： CH3(CH2)10CH2OSO3－ Na＋ ， 它能使蛋白質(zhì)變性、肽鏈伸展，并吸附在伸展的肽鏈上，吸附的量與鏈長成比例。在電泳之后 ,欲檢測(cè)目標(biāo)蛋白的存在 ,可以先將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上 ,然后用目標(biāo)蛋白產(chǎn)生的抗體與之產(chǎn)生抗原 抗體反應(yīng) ,最后可用連接有堿性磷酸酯酶或辣根過氧化酶的第二抗體 (通用抗體 )與第一抗體反應(yīng) ,加入能與抗體共接的酶反應(yīng)生成有色物質(zhì)的生色液 ,即可十分可靠地檢到的目標(biāo)蛋白 (圖 246)。 二 、 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與鹽析分離 蛋白質(zhì)在水中可形成一種穩(wěn)定的親水膠體 。 沉降平衡法 ，適用于沉降系數(shù)相近，但密度不同的蛋白質(zhì)。 練習(xí)題 1. 某種蛋白質(zhì)當(dāng)用凝膠過濾法測(cè)定其分子量為 90kD，而用SDSPAGE測(cè)定其分子量為 60kD，無論是否有巰基乙醇存在都如此。 毫無例外 , 每一種化學(xué)反應(yīng)都有一個(gè) △ G?。 反應(yīng)的平衡與△ G0′ （產(chǎn)物與反應(yīng)物所固有的標(biāo)準(zhǔn)自由能之差）有著密切的關(guān)系，但反應(yīng)速度則與△ G?有關(guān)。 酶的 活性中心可分兩部分： 參與和底物結(jié)合的 結(jié)合部位 (binding site) 及直接參與催化反應(yīng)的 催化部位 (catalytic site) 。 ,肽鍵的形成很可能是 50S核糖體亞基催化的。 Section 2. 酶的命名與分類 一 . 命名原則 例如：乙醇脫氫酶 1).應(yīng)標(biāo)明酶的所有底物及催化的性質(zhì)，并用 : 符號(hào)把底物分開。B ←→ A + B 例如： （圖 34） (isomerases)：催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變： A ←→ B 如異構(gòu)酶和消旋酶催化的反應(yīng)。這就是酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究的基本內(nèi)容。一般以產(chǎn)物的生成速度代表整個(gè)酶催化反應(yīng)速度，而產(chǎn)物的生成取決于中間物的濃度 . 因此 , 整個(gè)酶促反應(yīng)的速度取決于中間物的。 此外 , 在酶的純化工作中還要計(jì)算兩個(gè)具有實(shí)際意義的項(xiàng)目 , 即 純化倍數(shù)和回收率 (產(chǎn)量 %)： 純化倍數(shù) = 每次比活力 /第一次比活力 回收率 （產(chǎn)量 %） =(每次的總活力 /第一次總活力 ) 100 二 、酶反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué) 酶動(dòng)力學(xué)研究的是酶催化反應(yīng)的速度，描述酶作為催化劑的生物學(xué)作用 , 描述酶是怎樣完成它們所催化的反應(yīng)。 可分為 需氧脫氫酶、氧化酶 和 不需氧脫氫酶 。因此 , 一種催化抗體便能促使它的底物形成轉(zhuǎn)換態(tài)構(gòu)象，從而加速這一反應(yīng)。另外一個(gè)例子是 四膜蟲 26S rRNA前體中的插入順序的切除與兩端片段的正確拼接不需要蛋白質(zhì)的催化，是一種自我剪接的過程。 prosthetic group)， 它們是這類酶的催化活性的必要條件，缺少它們，酶的催化作用就會(huì)消失。酶的存在，象其他催化劑一樣，只能降低達(dá)到轉(zhuǎn)換態(tài)所需的活化能而不能改變反應(yīng)的平衡，它唯一的作用是加速反應(yīng)物和產(chǎn)物的相互轉(zhuǎn)化。 很顯然 , 轉(zhuǎn)換態(tài)越能有效的達(dá)到，反應(yīng)的速度就越大。B 假若用化學(xué)的方法先將 B物質(zhì)與一種不溶性載體 (R) 偶聯(lián)，得到 RB，偶聯(lián)到 R上的 B不喪失與 A結(jié)合的能力的話，那麼，將含有 A的混合蛋白通過裝有 RB的層析柱時(shí)， A將與 B結(jié)合 , 形成 R－ B 離子強(qiáng)度 (μ) ＝ ΣCZn21/2 三、 蛋白質(zhì)的沉降作用及超離心分離 沉降速度 (ν = dx / dt )與蛋白質(zhì)分子的大小和密度有關(guān)。 弱酸性的陽離子交換劑一般適合于分離 pI＞ 。 ◎ 免疫印跡 (Immunoblotting)或蛋白質(zhì)印跡 (Western blotting)是檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)的一項(xiàng)十分有效的方法。以聚丙烯酰胺凝膠為支持物，可進(jìn)行非變性電泳和變性電泳。 ▲ 目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離純化程序主要包括 : ⑴ 材料的選擇； ⑵組織勻漿和破碎細(xì)胞獲取粗提取液；⑶蛋白質(zhì)初步提純；⑷選擇一種或幾種合適的方法除去雜蛋白 ,直至完全純化；⑸目標(biāo)蛋白的鑒定。 蛋白質(zhì)在表達(dá)功能的過程中，其構(gòu)象發(fā)生變化的現(xiàn)象叫做 變構(gòu)作用或別構(gòu)作用 (allosteric efect)。血紅蛋白的兩個(gè) αβ原體呈雙重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱 （圖 239） 。 二、 血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 肌紅蛋白是由 153個(gè) aa殘基組成的單鏈蛋白， 整個(gè)分子被包裝成一個(gè)緊密的實(shí)體 (圖 237)。 Pro、 Gly往往出現(xiàn)在 β拐角處，而 Val則不會(huì)出現(xiàn)。 蛋白質(zhì)的變性只破壞其空間結(jié)構(gòu)而不破壞它的一級(jí)結(jié)構(gòu)；蛋白質(zhì)的變性包括從有序到無序的轉(zhuǎn)變。 ? 匯聚酶的活性部位 . 許多酶的催化效力來自單個(gè)亞基的寡聚結(jié)合。 表面積 /體積比越小，那么一個(gè)物體的半徑就越大。 在研究寡聚體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中，有時(shí)使用 原體 (protomer)這一名稱。偶極與偶極間的相互作用包括永久偶極間的相互作用、永久偶極與誘導(dǎo)偶極間的作用和瞬時(shí)偶極間的作用 （圖 232） 。平均直徑約 。 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu) 是指蛋白質(zhì)分子中的所有原子的三維空間排列，包括它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)要素 (如 α 螺旋和 β 片 ) 和它們的側(cè)鏈在空間上的相互關(guān)系。 轉(zhuǎn)角和卷曲結(jié)構(gòu) 大多數(shù)蛋白質(zhì)都是球狀的。 α 螺旋構(gòu)象 不僅存在于象 α 角蛋白這樣的纖維蛋白質(zhì)中，而且 在球狀蛋白質(zhì)分子中也廣泛存在 。 螺旋結(jié)構(gòu)是有規(guī)律的主鏈結(jié)構(gòu) α 螺旋 (α helix)是一種常見和穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu) （圖 221） 。 但這兩個(gè)單鍵的旋轉(zhuǎn)也受到主鏈的酰胺氫和羰基氧的障礙和 α 碳原子上的側(cè)鏈基團(tuán)的大小和性質(zhì)的限制。 X射線晶體衍射可用來研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) ,核磁共振 (NMR)光譜可用來研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。 羧肽酶 B能專門水解 C末端的 Arg和 Lys，對(duì)其它殘基不起作用。 1. 氨基酸的組成分析 蛋白質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)條件下經(jīng)酸水解后 , 進(jìn)行氨基酸的組成分析 .通過組成分析基本上可推測(cè)出部分水解所產(chǎn)生的肽碎片的數(shù)目。通常我們把這些肽類統(tǒng)稱為生物活性肽。 在某些蛋白質(zhì)中， N末端往往被甲?；蛞阴；忾]；也有些蛋白質(zhì)的 C末端被修飾成酰胺。 2. 與甲醛的反應(yīng) 3. 與二硝基氟苯的反應(yīng) 4. 與苯異硫氰酸的反應(yīng) 5. 與二甲氨基萘 1磺酰氯（ DNSCl）的反應(yīng) 6. 成酯和成鹽反應(yīng) 7. 與茚三酮的反應(yīng) Section 3 肽 一．肽、肽鏈和肽鍵 氨基酸與氨基酸之間可以通過 α 氨基和 α 羧基形成的酰胺鍵共價(jià)地結(jié)合在一起 ,這樣形成的產(chǎn)物叫做肽（ Peptide）。 ∝ Q/r 如果它們?cè)诖笮》矫嬉矝]有明顯的的差別，帶電質(zhì)點(diǎn)的遷移率可用下式表示： 181。 四、紫外吸收特性： 酪氨酸和色氨酸在 280nm處具紫外吸收特性，蛋白質(zhì)通常含有這樣的氨基酸，故可以在 280nm處測(cè)定蛋白質(zhì)的含量 ,并利用下式計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。 N元素是蛋白質(zhì)的特征性元素，根據(jù)對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)的 N元素分析，其含量相近，一般在 15—17% ，平均為 16% 。 Chapter 2 蛋 白 質(zhì) (Protein) Section 1 蛋 白 質(zhì) 概 述 一 . 蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)的最重要的物質(zhì) ① 蛋白質(zhì)約占細(xì)胞干重的 50%以上。 所選擇的緩沖系統(tǒng)反映了對(duì)接近 pH7的 pK值以及緩沖劑組成與細(xì)胞代謝機(jī)構(gòu)的一致性兩方面的需要。 弱電解質(zhì)的 pK往往位于滴定曲線的中點(diǎn) 。 HendersonHasselbalch方程對(duì)于計(jì)算含有已知濃度的弱酸和它的共軛堿的溶液的 pH來說是非常有用的。相應(yīng)地，醋酸離子（ CH3COO－ ）是醋酸（ CH3COOH）的共軛堿，銨離子（ NH4＋ ）是氨（ NH3）的共軛酸。 根據(jù)水的離子化及其平衡常數(shù)，可以推導(dǎo)表達(dá)水溶液氫離子濃度的方程式： pH ＝ log(1/[H＋ ])＝ –log[H＋ ] 由于純水的 [H＋ ] ＝ 107mol當(dāng)平衡確立時(shí)，沒有水和溶質(zhì)的進(jìn)一步凈流動(dòng)，雖然分子繼續(xù)在運(yùn)動(dòng)。 例如，溶質(zhì)的存在能降低水的冰點(diǎn)和升高水的沸點(diǎn)，因?yàn)槿苜|(zhì)的存在使水分子更難以結(jié)成冰，也更難以從溶液逃溢出變成氣態(tài)。膠束（或微團(tuán)）（ micelle）是由數(shù)千種中極兩性化合物構(gòu)成的小球（ 圖 1－ 9 中極兩性分子在水溶液中形成膠團(tuán) .）。因此，非極性溶質(zhì)的聚集能夠減小所占空間的表面積，隨之導(dǎo)致非極性溶質(zhì)表面的水的有序化程度總量降低。 二、水的溶劑特性 溶解度取決于溶質(zhì)分子與溶劑分子之間的相互作用力以及溶質(zhì)分子之間的相互作用力。 水的氫鍵形成具有協(xié)同的性質(zhì) 。 Section 2 水 在生物化學(xué)中，水存在的意義是顯而易見的： ① 幾乎所有生物分子隨環(huán)境中水的物理和化學(xué)性質(zhì)而呈現(xiàn)它們的形態(tài)。mol1范圍。當(dāng)把組成它們的構(gòu)件單位以字母排列時(shí)，可以組成有意義的詞語，然而并非所有生物大分子都含有信息。蛋白質(zhì)由氨基酸構(gòu)成，核酸由核苷酸構(gòu)成，多糖由單糖構(gòu)成。這種多樣性可因 N、 O和 H原子的參與而進(jìn)一步擴(kuò)大。 由于共價(jià)鍵的強(qiáng)度與所涉及原子的原子量是成反比的，因此， H、 C、 N和 O彼此間能形成最強(qiáng)的共價(jià)鍵。被生物利用的能量形式是特殊的生物分子。生 物 化 學(xué) 主講教師 : 張 楚 富 Chapter 1 生物化學(xué)導(dǎo)論 生物化學(xué)是研究生命分子和生命化學(xué)反應(yīng)的科學(xué)，是運(yùn)用化學(xué)的原理在分子水平上解釋生物學(xué)的科學(xué)。 ● 生命系統(tǒng)能活躍地進(jìn)行能量轉(zhuǎn)換，生物高度組織化的結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的維持依賴于從環(huán)境捕獲能量的能力。 此外，H、 C、 N和 O是元素周期表中最輕的元素。 這兩種性質(zhì)對(duì)于碳所形成的線性、分支以及環(huán)狀的化合物的驚人多樣性是極為重要的。 三、生物分子的特性反映它們對(duì)生命狀態(tài)的適應(yīng) 生物大分子和它們的構(gòu)件具有方向性 生物大分子是由單位元件構(gòu)筑而成的。蛋白質(zhì)和核酸的構(gòu)件單位是以非顯著重復(fù)方式排列的，它們的順序是獨(dú)特的。這些作用力一般介于 4–30 kJ這些復(fù)雜大分子的有序結(jié)構(gòu)的喪失 (也就是變性 )伴隨著功能的消失。 一、水的結(jié)構(gòu) 單個(gè)水分子的兩個(gè)氫原子共價(jià)地與氧原子結(jié)合，呈現(xiàn)一種非線性排列 （圖 1－ 4a,b） 。結(jié)果使連接分子的氫鍵網(wǎng)是無規(guī)則的和可變的；而且，這樣的氫鍵網(wǎng)是不斷地被打斷和重新形成， 因而液態(tài)水是由快速波動(dòng)的三維網(wǎng)狀的氫鍵結(jié)合的 H2O分子構(gòu)成 (圖 1－ 6a)。當(dāng)非極性溶質(zhì)彼此相遇而聚集時(shí)，它們所占據(jù)的空間的表面積小于它們各自單獨(dú)占有空間的表面積之和。 因此，當(dāng)中性兩性化合物分子與水溶劑相互作用時(shí)，中極兩性化合物趨向形成結(jié)構(gòu)上有序的排列。 依數(shù)性是溶液的一種物理性質(zhì)，它取決于溶質(zhì)的濃度而不是溶質(zhì)的化學(xué)特性。 分子的這種隨機(jī)運(yùn)動(dòng)叫做擴(kuò)散（ diffuse） 。 質(zhì)子經(jīng)氫鍵網(wǎng)快速遷移的質(zhì)子跳躍（ proton jumping）為生物學(xué)上許多重要的質(zhì)子轉(zhuǎn)移（例如快速的酸 堿反應(yīng)）提供了解釋 。按照這一定義，堿 酸反應(yīng)可以表述為： HA ＋ H20 → H 3O＋ ＋ A－ 酸（ HA）與堿（ H2O）反應(yīng)，形成酸的共軛堿（ A－ ）和堿的共軛酸（ H3O＋ ）。當(dāng)某種酸 [HA]和它的共軛堿 [A－ ]的濃度相等時(shí)， log([A－ ]/[HA])＝ 0，溶液的pH在數(shù)值上相當(dāng)于酸的 pK值。此時(shí)溶液中的 HAc和 Ac－ 相等， pH＝ pK. 因此，人們可以用實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定弱電解質(zhì)的 pK值。 生物有各種保持它們細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外液體 pH基本恒定的機(jī)制，但是阻止有害 pH變化的最重要的機(jī)制由緩沖系統(tǒng)提供。 此外，許多生物分子，例如蛋白質(zhì)以及小分子的有機(jī)物，由于含有多個(gè)酸 堿基團(tuán)，它們?cè)谏?pH范圍內(nèi)都是有效的緩沖系統(tǒng)的組分。