【正文】 他發(fā)現(xiàn)當(dāng)蔗糖的濃度比酶的濃度高許多時(shí)，反應(yīng)速度不再取決于蔗糖的濃度，即是說，反應(yīng)速度相對(duì)于蔗糖來說是零級(jí)反應(yīng)。 2. 酶的活力單位 . 國際酶學(xué)委員會(huì)規(guī)定 , 一個(gè)酶活力單位 (unit,u) 是指在 25℃下 , 其它條件如 pH及底物濃度均采用最適條件 , 在 1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1μ mol底物的酶量 (或轉(zhuǎn)化 1μ mol底物的有關(guān)基團(tuán)的酶量 ).但是，酶的活力單位常根據(jù)實(shí)際需要來規(guī)定。 例如： L谷氨脫氫酶催化的反應(yīng)是： （圖 33） 谷氨酸： NAD+脫氫酶 (脫氨 )。催化抗體 (catalytic antibodies)又叫做抗體酶 (abzymes)。這些 具有催化活性的 RNA，叫做 Ribozyme，意即酶活性 RNA。一般無機(jī)催化劑對(duì)它們所作用的底物沒有這種嚴(yán)格的選擇性。典型的酶促反應(yīng)速度比無催化劑存在的反應(yīng)要高出 106～ 1012倍。 二、酶能快細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速度 按照能量學(xué)的觀點(diǎn) ,一個(gè)化學(xué)反應(yīng)并不是從反應(yīng)物直接向產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行的。 常用的有葡聚糖凝膠 (sephadex,)或瓊脂糖凝膠(sepharose) 作為層析柱的填充物 。 任何物質(zhì)的溶解度都取決于溶質(zhì)分子間的相對(duì)親和力及溶質(zhì)分子與溶劑分子的相對(duì)親和力。鹽類的存在可降低離子交換劑的離子基團(tuán)和蛋白質(zhì)相反電荷基團(tuán)之間的靜電吸引。 ● 電泳后的蛋白質(zhì)檢測(cè)： ◎ 考馬斯亮藍(lán)染色 是常用的一項(xiàng)電泳染色方法 ,是根據(jù)考馬斯亮藍(lán)能與蛋白質(zhì)多肽鏈定量結(jié)合的原理而建立起的。 所有的蛋白質(zhì)，不管它具有什么樣的功能，都能在細(xì)胞內(nèi)起一定的緩沖作用。目前常使用的分離純化的方法或技術(shù)都是在了解蛋白質(zhì)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上建立的。這與肌紅蛋白分子只有一個(gè)氧結(jié)合部位不同。 血紅蛋白的 α亞基和 β亞基在結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上彼此相關(guān)，也與肌紅蛋白相關(guān)。肌紅蛋白是組織細(xì)胞內(nèi)的氧貯存者。 該實(shí)驗(yàn)證明了 蛋白質(zhì)的特定的空間構(gòu)象是由它的一級(jí)結(jié)構(gòu)即氨基酸順序決定的。 五、蛋白質(zhì)的變性 (denaturation) 天然蛋白質(zhì)在構(gòu)象上的亞穩(wěn)定性的，很容易受到許多不利因素的影響而破壞其結(jié)構(gòu)。 例如HIV(人類免疫缺陷性病毒 )蛋白酶 是由相同亞基構(gòu)成的一種二聚體蛋白質(zhì)，它履行與同源細(xì)胞的酶相似的功能 (即都能催化蛋白質(zhì)的水解 )，但是 HIV蛋白酶的分子量只是那些由單一肽鏈構(gòu)成的酶的一半。 但是，蛋白質(zhì)不可能倒置或鏡像對(duì)稱，因?yàn)檫@樣一種對(duì)稱結(jié)合把手性 L殘基轉(zhuǎn)變成 D殘基。 在寡聚蛋白質(zhì)中，每一條折疊的多肽鏈稱為 亞基 (subunit), 亞基可相同也可不同，取決于寡聚蛋白質(zhì)的亞基組成。 蛋白質(zhì)具有眾多的氫鍵供體和受體，包括主鏈上的羰基和酰胺基及極性側(cè)鏈基團(tuán)。 ● β 桶式 (β barrel) 基元： 由連續(xù)的 β 片卷筑而成 (有三種不同的形式 )。 卷曲結(jié)構(gòu) 是一種難以描述的多肽鏈走向，也存在于球狀蛋白質(zhì)分子中。 絲心蛋白 的 X射線晶體衍射分析表明，其空間結(jié)構(gòu)與 α 角蛋白完全不同 ，呈現(xiàn)為 反平行的 β 片狀 （ 圖 226a 圖 226b） 。氫鍵是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用力 。在多肽鏈中，任何一對(duì)扭角如發(fā)生變化，多肽鏈主鏈的構(gòu)象必然發(fā)生相應(yīng)的變化，如果所有與 Cα 相連的這一對(duì)扭角都分別相等，則多肽鏈主鏈呈現(xiàn)為有規(guī)律現(xiàn)象。 但位于肽基兩側(cè)的 Cα 與氮原子間的連接鍵是純粹的單鍵， Cα 與羰基碳原子間的連接鍵也是純粹的單鍵 。 HbA: H3＋ N－ ValHisLeuThrProGluGluLys－ COO－ HbS: H3＋ N－ ValHisLeuThrProGluValLys－ COO－ Section 4 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu) 一 .蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的概念及研究方法 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象 是指蛋白質(zhì)多肽鏈主鏈在空間上的走向及所有原子和基團(tuán)在空間中的排列與分布。下面是一個(gè)典型的多肽，用胰蛋白酶 (糜酶 )、胰凝乳蛋白酶和溴化氰分別處理所得到的結(jié)果： ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Ala—Arg—Arg—Met—Phe—Ala—Lys—AspPheLeuLys 用胰酶處理 ： 用糜酶處理 ： 用溴化氰處理 ： AlaArg AlaArgArgMetPhe AlaArgArgMet Arg AlaLysAspPhe PheAlaLysAspPheLys AspPheLeuLys LeuLys MetPheAlaLys 5．肽碎片的氨基酸順序分析： ? Edman降解法 （圖 217） ：專用試劑是 苯異硫氰酸。有二條途徑：一條是 直接測(cè)定 多肽鏈的氨基酸順序；另一條是 間接的 ，即從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。 等電點(diǎn)的差別反映出它們的氨基酸組成不同和側(cè)鏈可電離基團(tuán)的種類和性質(zhì)的差別 。這些多肽鏈在長(zhǎng)度上一般超過 40個(gè)以上的氨基酸殘基，最大者甚至超過 4000個(gè)氨基酸殘基。 除了電荷作為主要分離因素外，氨基酸側(cè)鏈與樹脂的非極性骨架之間的相互作用也是影響分離的因素。 六．氨基酸的電泳分離和離子交換： 1. 氨基酸的電泳分離 電泳 (Electrophoresis)是指帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中的移動(dòng) （圖29） 。 二 . 氨基酸的結(jié)構(gòu)和分類： 根據(jù)氨基酸側(cè)鏈 R基的極性 ， 20種氨基酸可分成 4類 。 ⑥ 肌肉收縮、物質(zhì)的運(yùn)輸、結(jié)締保護(hù)、病毒對(duì)宿主的感染等都是蛋白質(zhì)在起作用。/H2CO3）是生物體內(nèi)的兩種重要的緩沖系統(tǒng)。細(xì)胞過程（例如代謝）取決于酶的活性，而酶的活性又顯著地受 pH的影響。當(dāng) H＋ 被中和時(shí)，更多的 HAc解離成 H＋ 和 Ac－ .當(dāng)進(jìn)一步加入 NaOH時(shí) , pH隨 Ac－ 的積累而逐漸升高。 因此 ， [H2O]項(xiàng)通常與解離常數(shù)合并 ， 即： Ka ＝ K[H2O]＝ [H＋ ][A－ ]/[HA] (2) 由于酸解離常數(shù)象 [H＋ ]值一樣使用起來不方便 ， 因此可用公式將其轉(zhuǎn)換成的 pKa值 (為了使用的方便 ,將下標(biāo) a省去 ): pK ＝ － logK (3) 溶液的 pH由酸和堿相對(duì)濃度決定 一種溶液的 pH和酸以及它的共軛堿之間的相互關(guān)系可以很容易推導(dǎo)出來。因而正確評(píng)價(jià)酸 堿化學(xué)是了解許多分子的生物學(xué)作用所必須的 。水合氫離子的質(zhì)子可以很快地一個(gè)水分子跳躍到另一個(gè)水分子 （圖 111） 。 這種壓力與溶質(zhì)的濃度成正比。細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞周圍的液體是被各種溶質(zhì)充塞的，這些溶質(zhì)包括從很小的無機(jī)離子到巨大的分子聚集體。這類化合物既有親水性又有疏水性。為了重新獲得它們失去的氫鍵能，表面的水分子指向它們自身， 以四面體氫鍵的方式形成一種封閉的、類似籠子的氫鍵網(wǎng) （圖 17） 。 液態(tài)水的結(jié)構(gòu) 由于液態(tài)水的每個(gè)分子約 10－ 12秒重新定位一次，因此很少有實(shí)驗(yàn)技術(shù)能探測(cè)這些水分子的瞬間排列。 ⑤ 水的離子化產(chǎn)物 (H＋ 和 OH－ )是蛋白質(zhì)、核酸以及膜的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)鍵決定者。 弱的作用力把生物限制在一個(gè)窄范圍環(huán)境條件中 生物大分子僅在窄的環(huán)境條件下 (例如溫度、離子強(qiáng)度以及酸 堿度等 )才有功能上的活性。 非共價(jià)作用力維持生物大分子的結(jié)構(gòu) 共價(jià)鍵把原子結(jié)合在一起形成分子，非共價(jià)作用力是分子內(nèi)或分子間的原子之間的吸引。 因此， 它們的結(jié)構(gòu)應(yīng)該是有“感應(yīng)”（ sense）的或者說是有方向的 （圖 1－ 3） 。細(xì)胞可分為兩種類型，即真核生物細(xì)胞和原核生物細(xì)胞。 碳的共價(jià)鍵有兩個(gè)特別值得注意的性質(zhì)。 H、 O、 C和 N構(gòu)成了人體原子總量的 99%以上，其中大多數(shù) H和 O以 H2O形式出現(xiàn)。 盡管生命存在著驚人的多樣性、存在著生物結(jié)構(gòu)和維持生命必需的機(jī)制的復(fù)雜性，但是生命的功能最終是可以用化學(xué)的原理來解釋的。 Section 1 生命、細(xì)胞和生物分子 分子是無生命的 , 然而分子卻可以以適當(dāng)?shù)臄?shù)目和方式構(gòu)成生命。 ● 生命系統(tǒng)具有顯著的自我復(fù)制能力。 生物分子是含碳的化合物 所有生物分子都含有碳。細(xì)胞器僅在真核生物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。 因此，從某種意義上說 ,它們是有“頭”和有“尾”的。這類同聚多糖不可能含有什么信息。 生命的復(fù)雜而高度組織化的型式取決于生物分子彼此識(shí)別和相互作用的能力。 ③ 水本身活躍地參與支撐許多化學(xué)反應(yīng)，水的離子化組分 (H＋ 和OH－ )往往作為真正的反應(yīng)物參與反應(yīng)。（同樣，作為氫鍵供體的氫鍵結(jié)合的水分子也是一種更好的氫鍵受體）。 三、疏水相互作用 非極性物質(zhì)（或者生物大分子的非極性功能基團(tuán)）不易與水形成氫鍵。 熵是一個(gè)系統(tǒng)有序程度的一種量度。因此，中極兩性化合物的這種特殊的性質(zhì)是生物膜構(gòu)成的基礎(chǔ)。當(dāng)溶質(zhì)與純水被一層只允許水分子通過而不允許溶質(zhì)通過的半透膜分開時(shí)，水移動(dòng)進(jìn)入到溶液中，以便使膜兩側(cè)的濃度趨于平衡。人們通常用下面的式子表達(dá)水的離子化： H2O ←→ H ＋ ＋ OH— 實(shí)際上，自由的 H＋ 是不存在的，而是與水分子結(jié)合，以水合氫離子（ H3O＋ ）的形式存在。 七、酸 堿化學(xué) 由水解離產(chǎn)生的 H＋ 和 OH－ 是生物化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)。L1/當(dāng)用已知濃度的堿（通常使用 NaOH）滴定醋酸溶液時(shí)，獲得如 圖 1－ 12所示的滴定曲線。如醋酸的 pK為 、咪唑的 pK為 、 NH4＋ 的 pK為 。175。 ③ 催化生物體內(nèi)幾乎所有化學(xué)反應(yīng)的酶是蛋白質(zhì)。 四、 蛋白質(zhì)是基因編碼的 直接參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸在遺傳上都存在相應(yīng)的密碼，這些密碼子存在于基因的核苷酸順序中，分子生物學(xué)研究表明，基因的核苷酸順序通過轉(zhuǎn)錄拷貝到 mRNA上，mRNA的編碼信息，即 三聯(lián)密碼子直接決定著蛋白質(zhì)多肽的氨基酸順序。從滴定曲線可看出，每種氨基酸是在它的 pKa值附近而不是在它的 pI處發(fā)揮其緩沖作用。 2. 離子交換層析是分離分析氨基酸的有效方法 離子交換劑共價(jià)地結(jié)合許多可解離為陰離子或陽離子的基團(tuán)，可以與周圍溶液中的其它相反離子或離子化合物結(jié)合 （圖210） 。 由氨基酸借肽鍵所形成的一條線性的鏈狀分子就叫做 肽鏈(peptide chain) 。從該模式結(jié)構(gòu)可以看出， 每種多肽或蛋白質(zhì)都有相同的主鏈（ backbone） ,而每種多肽或蛋白質(zhì)之間的差別則表現(xiàn)在多肽鏈中的氨基酸殘基順序的不同。有的呈環(huán)形，有的有分支，有的還含有 D氨基酸和氨基酸類似物 （圖 213） 。 丹磺酰氯 （圖 214） 為一種更有效的試劑，靈敏度比 DNFB法高 100倍。羧肽酶 C能水解 C末端的 Pro. ： 胰酶： AlaArg Arg MetPheAlaLys AspPheLeuLys 糜酶： AlaArg—ArgMetPhe AlaLys—AspPhe LeuLys 全順序 AlaArg—ArgMetPheAlaLys—AspPheLeuLys 六．蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的生物學(xué)意義： 1. 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異 同源蛋白質(zhì) (homologous proteins) 以胰島素和細(xì)胞色素 c為例說明。一般呈有規(guī)律的空間折疊。多肽鏈主鏈的構(gòu)象可用每 α 碳原子的一對(duì)扭角來描述。 ,ψ ＝ 47176。 由于在每種折疊形式中 , 每對(duì)扭角都是分別相等的 , 故這兩種結(jié)構(gòu)都是有規(guī)律的主鏈構(gòu)象 。在許多蛋白質(zhì)中都可觀察到一種 稱作 β 轉(zhuǎn)角 (β turn orβ –bend) 的結(jié)構(gòu)，它是由 4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成 （圖 227） 。這些組合有： ● β α β 基元： 兩個(gè)平行的 β 鏈由一個(gè) α 螺旋右手交聯(lián) ,為最常見的一種組合 （圖 229） 。 2. 蛋白質(zhì)空間構(gòu)象穩(wěn)定的因素 蛋白質(zhì)多肽鏈在生理?xiàng)l件下折疊形成特定的空間構(gòu)象顯然是熱力學(xué)上一種有利的過程，是各種作用力相互作用、精巧平衡的結(jié)果 。 這種力是維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定的主要的作用力。在血紅蛋白中，一個(gè) α 亞基和一個(gè) β 亞基組合成一個(gè)原體。 ? 遺傳上的經(jīng)濟(jì)性和有效性 . 蛋白質(zhì)單體的寡聚結(jié)合對(duì)一種生物來說，在遺傳上是經(jīng)濟(jì)的。 例如，細(xì)菌谷氨酰胺合成酶的活性部位就是由相鄰亞基對(duì)構(gòu)成的，解離的單體是無活性的。 ： Anfinsen證明，變性的核糖核酸酶 A（ RNase A）只有處在天然構(gòu)象穩(wěn)定的條件下才能