【正文】 的支撐整個項目的順利實施。 2） 已經(jīng)對整個造血系統(tǒng)不同類型細胞進行全面表觀遺傳分析，為本課題的開展提供有利的依據(jù)。此外，課題組骨干多是在一線工作的青年科技工作者 。目前本依托單位十分重視本項目的申請和誘導(dǎo)多能干細胞（ iPS）技術(shù)的疾病模型與機理研究方面的相關(guān)研究，并已提供了很好的前期工作條件，包括場地、設(shè)備、人員和經(jīng)費支持等。項目參加人員長期以來得到了國家科技部、中科院、自然科學(xué)基金委員會和地方政府等的大力支持，均能圓滿完成科研任務(wù)。課題參加單位第二軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)研究所和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所均為國家重點實驗室，具備完成本項目課題的條件。課題二通過對重編程過程中的免疫源性變化及不同組織來源 iPS免疫源性區(qū)別進行全面的分析， 與課題一中結(jié)果相驗證，系統(tǒng)的分析重編程中免疫源性變化這一科學(xué)問題。對于基因突變的遺傳性疾病，如果應(yīng)用 iPS治療，就要取其自身來源的體細胞誘導(dǎo)成為 iPS，該細胞中仍然存在基因突變，這個突變的基因位點在治療前必須被修復(fù)。 iPS細胞在誘導(dǎo)的過程中存在一個染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重塑、某些基因發(fā)生重編程的特殊環(huán)境。通過這四個課題的緊密有機合作為點突變遺傳病患者的治療提供新的治療手段。總之，這些課題緊緊圍繞本項目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題，有望在 iPS研究方面取得進展乃至突破。 研究內(nèi)容： 1 對不同來源 iPS及其來源細胞、胚胎干細胞全基因組甲基化分析。提取的 DNA質(zhì)量檢測合格后進行重硫酸鹽處理。對尋找到的關(guān)鍵基因進行重硫酸鹽測序法驗證。收集提取實驗室已建立的不同組織來源，如胎盤、臍帶、皮膚來源 iPS及其來源細胞，胚胎干細胞系 H H9 RNA。將獲得的 cDNA利用 Solexa測序儀進行測序。對尋找到的關(guān)鍵基因進行實時定量 PCR測序。 利用不同抗體，用免疫共沉淀技術(shù)將不同組蛋白修飾的 DNA片段拉下來，利用 Solexa測序儀進行測序。 經(jīng)費比例： 35% 承擔單位： 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、中國科學(xué)院北京基因組研究所、南方醫(yī)科大學(xué) 課題負責人： Miguel Esteban 學(xué)術(shù)骨干： 吳佳妍、鐘梅、趙東宇、徐建勇 課題 2 ： 不同組織與疾病重編程過程中的免疫源性全景分析與機制研究 研究目標： 通過研究 iPS細胞在再分化過程免疫原性的變化以及在蛋白和基因水平檢測影響 iPS細胞免疫原性的關(guān)鍵因素，完成 iPS細胞的免疫原性全景分析；研究基質(zhì)微環(huán)境在 iPS細胞誘導(dǎo)形成以及再分化階段的影響，研究如何誘導(dǎo)機體不同的免疫細胞轉(zhuǎn)化為 iPS細 胞的方法，從中篩選出最安全和最高效的優(yōu)化方案。設(shè)計不同的體內(nèi)和體外實驗環(huán)境誘導(dǎo) iPS細胞再分化。 3 iPS細胞來源對 iPS細胞轉(zhuǎn)化率，免疫原性和致瘤率的影響及相關(guān)機制研究：研究誘導(dǎo)機體不同的免疫細胞轉(zhuǎn)化為 iPS細胞的方法，以及不同 iPS細胞來源對 iPS細胞轉(zhuǎn)化率，免疫原性和致瘤率的影響及相關(guān)機制，從中篩選出最安全和最高效的優(yōu)化方案。 5 研究腫瘤基質(zhì)微環(huán)境對 iPS細胞誘導(dǎo)和再分化的影響，探索腫瘤干細胞的形成與腫瘤基質(zhì)微環(huán)境的相關(guān)性：建立腫瘤基質(zhì)微環(huán)境體外研究平臺，研究其對對 iPS細胞誘導(dǎo)和再分化的影響，并在此基礎(chǔ)上建立腫瘤干細胞產(chǎn)生的模擬體系，探索腫瘤形成的細胞機制，為腫瘤病因?qū)W研究和腫瘤治療奠定基礎(chǔ)。地中海貧血 iPS常見突變位點修復(fù)技術(shù)，最終為點突變遺傳性疾病的治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。地中海貧血 iPS常見突變位點修復(fù) 建立哺乳動物細胞熒光報告系統(tǒng)： 構(gòu)建了帶有突變的 EGFP質(zhì)粒載體（ mEGFP），該載體模擬了地中海貧血基因突變類型中的起始密碼突 變，將 EGFP的啟動子 ATG突變?yōu)?TTG，因此不能表達綠色熒光蛋白。構(gòu)建含有這些突變類型報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，這些小鼠的體細胞具有突變的 EGFP，因此不表達綠色熒光蛋白。在誘導(dǎo)過程中加入 SSO，在重編程的過程中用 SSO更為有效得修復(fù) EGFP的突變位 點，并進一步對 iPS的形成和靶向性修復(fù)進行不同層次的鑒定。本課題構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠后，取具有點突變 mGFP的成纖維細胞培養(yǎng)，選擇合適的條件誘導(dǎo)其為 iPS細胞。 4 在上述工作的基礎(chǔ)上嘗試修復(fù)疾病來源的 iPS細胞中的突變基因，例如修復(fù)地中海貧血患者來源的 iPS細胞中的基因突變，并嘗試對修復(fù)后細胞的增殖和誘導(dǎo)分化。地中海貧血 iPS常見突變位點 1 針對 beta－地中海貧血特定突變位點鋅指文庫的設(shè)計組裝與在細菌雙雜交系統(tǒng)中的篩選。轉(zhuǎn)染鋅指核酸酶表達質(zhì)粒和供體質(zhì)粒到含有突變位點的穩(wěn)定細胞株，通過觀察和流式分析綠色熒光蛋白表達細胞的比例即可判定鋅指核酸酶的有效性，通過分析細胞凋亡的比例即可判定鋅指核酸酶作用的特異性和細胞毒性。 3 使用鋅指核酸酶對 beta地中海貧血患者 iPS細胞中突變等位基因進行原位矯正。利用 PCR方法擴增得到不含任何突變的 beta珠蛋白基因供體 DNA（ donor DNA）片段，并將該 DNA片段插入到 T載體，得到的 TDonorDNA質(zhì)粒進行測序鑒定。 對 TDonorDNA進行線性化處理以提高基因修復(fù)的效率，并同時可以去除載體骨架部分。 iPS單克隆，然后通過 PCR測序方法和突變檢測試劑盒篩選鑒定已經(jīng)糾正的 iPS細胞克隆。包括：核型分析，實驗所用質(zhì)粒的非特異性插入。 經(jīng)費比例： 20% 承擔單位： 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基 礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院 課題負責人： 黃粵 學(xué)術(shù)骨干： 呂湘、李峰、董文吉、陳峰 課題 4 ： 基于多能性差異機制的安全高效重編程及造血細胞定向分化新技術(shù)探索 研究目標： 改進非病毒體系人 iPS誘導(dǎo)技術(shù)，結(jié)合附加體、蛋白及小分子化合物，探索出安全高效誘導(dǎo)體系；通過建立帶造血報告基因 iPS細胞系，篩選不同促進造血分化化合物及支撐細胞，建立高效造血分化新技術(shù)，為 iPS技術(shù)最終臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。通過啟動子優(yōu)化，誘導(dǎo)因子優(yōu)化等方法，改進 附加體誘導(dǎo)技術(shù)，同時探索通過改進蛋白遞送胎優(yōu)化蛋白誘導(dǎo) iPS，同時結(jié)合表觀遺傳等分析結(jié)果，篩選能夠提高 iPS效率或替代因子小分子化合物，以上探索結(jié)果相結(jié)合最終建立高效安全的人 iPS誘導(dǎo)體系。 附加體質(zhì)粒可以在真核細胞中復(fù)制，并且其非整合特性預(yù)示著它將是安全的誘導(dǎo)系統(tǒng)之一。 直接向細胞內(nèi)遞送蛋白形式的外源誘導(dǎo)因子是最為理想與安全的 iPS誘導(dǎo)方式。本研究將開發(fā)新的一 系列蛋白遞送肽來提高iPS的效率。 誘導(dǎo)已分化細胞逆轉(zhuǎn)成為多能性干細胞需要關(guān)閉細胞的多個信號通路，目前有多個抑制信號通路的化合物。 2 建立高效人 iPS造血分化技術(shù)。 構(gòu)建帶有造血發(fā)育標記的 ips細胞系 利用鋅指蛋白酶技術(shù)，在 iPS或胚胎干細胞細胞系造血 Marker，如 CD34等啟 動子后加入 GFP報告基因，因此可以動態(tài)的觀測分化的過程。 利用造血報告細胞系篩選高效支持細胞 分離不同時期流產(chǎn)胎兒骨髓細胞，利用帶有報告基因 iPS或胚胎干細胞共培養(yǎng)，篩選出能高效誘導(dǎo)造血分化的支持細胞系。通過移植免疫缺陷鼠，檢測獲得的造血細胞功能。 2 利用流式分選儀器分別純化小鼠和人的各種免疫細胞群，分別誘導(dǎo)制備不同成體細胞來源的 iPS細胞。 4 建立哺乳動物細胞熒光報告系統(tǒng)， 并在細胞水平驗證載體構(gòu)建是否正確。 6 優(yōu)化附加體基因?qū)胂到y(tǒng)，開發(fā)新的蛋白遞送肽，同時篩選像 Vc一樣具有提高 iPS誘導(dǎo)效率的小分子化合物。 預(yù)期目標： 1 完成 2株 iPS細胞的全基因組甲基化測序。 3 建立小鼠和人不同免疫細胞來源地 iPS細胞庫。 5 建立誘導(dǎo) iPS細胞再分 化的體外模擬體系。 7 獲得非病毒系統(tǒng) iPS細胞并收集獲取不同時期的骨髓細胞以備后期建立造血分化平臺。 2 利用全基因分析高通量檢測不同成體細胞來源的 iPS細胞以及 iPS細胞在再分化過程免疫原性的變化 3 通過蛋白表達譜分析和表觀遺 傳學(xué)分析在蛋白和基因不同水平檢測影響iPS細胞免疫原性的關(guān)鍵因素 4 構(gòu)建含地中海貧血突變類型報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。 6 利用已經(jīng)成功建立的化合物等優(yōu)化非病毒 iPS系統(tǒng)誘導(dǎo)獲得 iPS細胞 7 過鋅指蛋白酶技術(shù)，構(gòu)建帶有造血發(fā)育標記并可進行動態(tài)觀測分化的 iPS細胞系。 2 尋找到 25個關(guān)鍵影響不同 iPS差異的因子。 5 得到含有突變類型報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，并通過 PCR等技術(shù)對構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠進行鑒定。 7 構(gòu)建帶有造血發(fā)育標記并可進行動態(tài)觀測分化的 iPS細胞系并以此篩選最適宜促進造血分化的骨髓細胞（時期）。 2 結(jié)合項目總體進展，補充部分必要 iPS細胞數(shù)據(jù)。 4 驗證重編程過程中利用 SSO技術(shù)修復(fù)基因。 6 進一步優(yōu)化穩(wěn)定高效的非病毒 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng) 7 利用帶有報告基因的 iPS或胚胎干細胞系以及篩選獲得高效支持細胞（骨髓細胞）共培養(yǎng)，通過加入造血相關(guān)的各因子誘導(dǎo)造血分化， 預(yù)期目標： 1 分析得到關(guān)鍵因子 5~10個進行 深入研究其作用機理 2 篩選出誘導(dǎo)機體不同的免疫細胞轉(zhuǎn)化為 iPS細胞安全和高效的優(yōu)化方案。 4 初步建立 iPS細胞造血分化新方法。 2 利用已建株的基質(zhì)細胞模擬基質(zhì)微環(huán)境，研究基質(zhì)微環(huán)境存在與否對 iPS細胞轉(zhuǎn)化率的影響，并通過已有的研究平臺檢測基質(zhì)微環(huán)境對 iPS細 胞免疫原性，致瘤率以及再分化的影響，并深入研究其相關(guān)機制； 3 取具有點突變 mGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細胞，在誘導(dǎo)過程中加入 SSO修復(fù)突變基因，觀察修復(fù)后 iPS細胞的增殖情況，在上述工作的基礎(chǔ)上嘗試修復(fù)疾病來源的 iPS細胞中的突變基因。 5 在非病毒 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，探索無動物源性的培養(yǎng)基條件，同時探索在無滋養(yǎng)層細胞條件下 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)的建立。 預(yù)期目標： 1 初步建立不同來源 iPS全景網(wǎng)絡(luò)圖。 3 完成基質(zhì)微環(huán)境中 iPS細胞誘導(dǎo)以及再分化研究的體外模擬體系 4 完成基質(zhì)微環(huán)境對 iPS細胞誘導(dǎo)以及再分化過程免疫原性影響的機制研究。 6 得出檢測鋅指核酸酶的修復(fù)突變效率，與 SSO介導(dǎo)的修復(fù)效率比較優(yōu)劣。 2020年 1月 8月 研究內(nèi)容： 1 根據(jù)數(shù)據(jù)分析與關(guān)鍵因子功能研究，回饋到重編程過程，深入探討其作用機理。 3 SSO修復(fù)后，對 iPS的多能性和靶向性修復(fù)進行不同層次的鑒定。 5 將各種 iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)進行綜合優(yōu)化，確立高效穩(wěn)定、無動物源性非病毒的最優(yōu) iPS誘導(dǎo)系統(tǒng)，并在該基礎(chǔ)上建立高效的 iPS細胞造血分化新方法。 3 成功增殖和誘導(dǎo)分化修復(fù)后疾病來源的 iPS細胞。 一、研究內(nèi)容 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題： iPS的研究和應(yīng)用將可能在多種影響人類健康的重大遺傳疾病包括 223。本項目所針對的下述關(guān)鍵科學(xué)問題的解決也將可能為 iPS 的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。 重編程過程中，是否會帶來其免疫原性的改變？其機制如何？這種改變是否會影響其在體內(nèi)的應(yīng)用？針對這種改變，如何有 效的通過免疫調(diào)控提高其使用的效率？該問題的解決將可克服 iPS 在體內(nèi)應(yīng)用時必然遭遇的難關(guān)，提高其治療效果并減少其應(yīng)用帶來的問題。 4. iPS 技術(shù)最終要應(yīng)用到臨床，有兩個關(guān)鍵技術(shù)問題必須解決，一個是如何安全高效的獲得 iPS 細胞，另一個是如何將 iPS 細胞安全高效的定向誘導(dǎo)為為所需的細胞。 2．在 iPS 細胞免疫原性全景分析和基質(zhì)微環(huán)境方面：監(jiān)測不同組織與疾病來源的 iPS 細胞在重編程和再分化過程免疫原性的變化，通過蛋白表達譜分析和表觀遺傳學(xué)分析在蛋白和基因不同水平 檢測影響 iPS 細胞免疫原性的關(guān)鍵因素，并在此基礎(chǔ)上進一步研究免疫干預(yù)方法；研究基質(zhì)微環(huán)境在 iPS 細胞誘導(dǎo)形成以及再分化階段的影響，并探索其潛在機制，以達到提高 iPS 細胞誘導(dǎo)成功率以及促進其定向再分化并安全應(yīng)用于臨床治療；研究如何誘導(dǎo)機體不同的免疫細胞轉(zhuǎn)化為 iPS 細胞的方法，以期從中篩選出最安全和最高效的優(yōu)化方案，同時通過機制研究深入探索成熟免疫細胞，造血干細胞， iPS 細胞以及腫瘤干細胞之間的相互關(guān)系，轉(zhuǎn)化的可能性和相關(guān)機制。血液系統(tǒng)遺傳疾病可能是 iPS臨床移植治療能夠被最先應(yīng)用的領(lǐng)域，本課題將在探索利用單鏈寡核苷酸介導(dǎo)的靶向性基因定點修復(fù)技術(shù)的同時，利用 SSO 修復(fù)和鋅指核酸酶技術(shù)，分別探索建立 223。 4．在建立高效安全人 iPS 技術(shù)和 iPS 細胞高效向造血定向分化方面：探索iPS 技術(shù)應(yīng)用到臨床所必須解決的兩個關(guān)鍵問題：首先要獲得安全高效的 iPS，然后能夠誘導(dǎo)其高效定向分化。 項目名稱： 人多能干細胞多能性維持和發(fā)育潛能差異的系統(tǒng)研究 首席科學(xué)家： 康九紅 同濟大學(xué) 起止年限： 至 依托部門： 教育部 上海市科委 二、預(yù)期目標 總體目標： 本項目以不同來源的 ES 和 iPS 細胞系為研究對象 ，以探索其多能性及穩(wěn)定維持、向特定譜系分化的潛能、臨床有效性及安全性差異的分子機制，并通過比較研究差異，建立 ES 和 iPS 細胞系在臨床應(yīng)用中的標準和根據(jù)不同目的篩選 ES和 iPS 細胞系的便捷方法為總體目標。通過本項目的實施，將獲得一批有自主知識產(chǎn)權(quán)的重要成果，提高國家科研實力，揭示 ES 和 iPS 細胞系間種種差異的機制，建立根據(jù)不同目的篩選適合 ES 和 iPS