【正文】 并研究該分子伴侶的體內作用；繼續(xù)從時間和空間順序上研究組蛋白修飾的繼承性模式； 3） 繼續(xù)獲得可結晶片段和復合物晶體；開展結晶條件的搜索，對已得到的晶體生長條件進行優(yōu)化；對衍射較好的蛋白晶體進行數(shù)據(jù)采集和結構解析；與其他組密切結合，開展已解結構的蛋白因子的功能研究；開展新的候選蛋白的克隆、表達與結晶乃至結構解析的工作； 4） 篩選最優(yōu)生長條件，收集衍射數(shù)據(jù)，開展結構解析；進一步開展基于先導化合物的小分子的設計與化學合成；深入開展基于已知的活性小分子化合物作為分 子探針在 iPS領域的化學生物學工作；在已知獲知蛋白質三維結1） 完成初篩影響胚胎干細胞定向分化的組蛋白去甲基化酶和 miRNA，初步明確其在 ES細胞定向分化中的作用；初步完成候選蛋白的 ES細胞建系工作；確定 13種卵母細胞來源與重編程相關的表觀調控蛋白的功能；通過實驗證實 ARC抗心肌凋亡 的能力和向心肌分化能力的提高； 2） 深入開展重要表觀遺傳調控蛋白在干細胞分化和重編程中的染色質結構轉換的影響；初步完成 Chipseq的結果分析；初步完成 PRC 研究；繼續(xù)組蛋白甲基化繼承性機制的研究； 3） 完成不同蛋白復合物或與核酸復合物的體外重構條件優(yōu)化；完成新發(fā)現(xiàn)表觀遺傳蛋白的克隆、表達與純化；完成 5～ 8個蛋白質、蛋白質復合體的結構測定。對得到的蛋白質結構進行結構分析和功能分析，撰寫論文； 4） 優(yōu)化出 最優(yōu)的晶體生長條件 ，收集蛋白質結構數(shù)據(jù)，解出 24個蛋白的結構；合成出一系列基于先導化合物的小分子；合成出幾個特定的小分子化合物探針；設計并合成一系列基于蛋白質三維結構的小分子底物。 5） 發(fā)表 SCI論文： IF5論文 3～ 6篇；爭取發(fā)表在 IF10的論文 2～ 3篇。 4） 篩選 復合物 晶體 的 生長條件， 研究底物和蛋白質的結合性質 ；利用合成出的小分子化合物開展篩選工作；將已知的活性小分子化合物作為分子探針，開展化學生物學工作來探明在 iPS的重編程及定向分化過程中起重要作用的蛋白；進一步深入開展基于蛋白質三維結構的小分子化合物計算機輔助設計和化學合成工作。其中單個蛋白的結構 1～ 2個，復合體結構 2～ 3個。通過復合物的結構研究表觀遺傳修飾酶和結構轉換蛋白復合物的分子機理和底物識別機理；爭取篩選出功能類似或優(yōu)于先導化合物的小分子。 研究內容 預期目標 第 四 年 1） 結合生物信息學分析、基因芯片和CHIP分析等方法，篩選受組蛋白去甲基化酶和 miRNA調控的靶基因；初步分析影響胚胎干細胞向心肌細胞、肝細胞分化的表觀調控網(wǎng)絡；初步進行分化肝細胞的動物實驗的功能檢測和安全評估；繼續(xù)研究重編程相關蛋白的功能；建立 ARC干細胞 庫 。 2） 完成干細胞定向分化過程中染色質結構和表觀遺 傳修飾的變化規(guī)律研究 。其中單個蛋白的結構 1～ 2個，復合體結構 2～ 3 個。 4） 研究表觀遺傳修飾酶和結構轉換蛋白復合物的結構與功能關系，尋找干細胞向心肌細胞、肝細胞定向分化和重編程的關鍵因子及其作用 。 利用小分子 研究內容 預期目標 度對新設計的小分子藥物進行驗證和優(yōu)化 ； 4） 解出表觀遺傳修飾酶和結構轉換蛋白復合物 結構 。 化合物探針探尋到新的靶標蛋白并開展結構和功能的化學生物學研究。 6） 申請發(fā)明專利： 48項。 2） 完成干細胞定向分化與重編程的表觀遺傳調控規(guī)律與調控因子的篩選與機制研究 。 5） 發(fā)表論文： IF 的論文 5 篇， IF10的論文 3篇（至少 12篇為 CNS 文章）。 結題總結 研究內容 預期目標 要作用的蛋白； 5） 進行項目總結，論文書寫。項 目分為四 個課題 ，其中兩個課題為功能和機制研究，兩個課題為三維結構解析和小分子化合物研究。 課題１ 干細胞向心肌細胞和肝細胞定向分化與重編程中 重要的和新的 表觀遺傳蛋白及復合物的篩選與功能研究 1) 在已有的工作基礎上，研究參與胚胎干細胞向心肌細胞和肝細胞定向分化過程中表觀遺傳調控蛋白的功能；利用小干擾 RNA 的方法，篩選參與 胚胎干細胞向心肌細胞和肝細胞定向分化的新組蛋白修飾酶、 DNA 甲基化修飾酶、染色質高級結構調控蛋白、核小體組裝和去組裝蛋白；篩選參與胚胎干細胞向心肌細胞和肝細胞定向分化的 miRNA 及調控這些 miRNA 的表觀遺傳調控酶及復合物；利用 RNAi 和 /或過表達的方法研究哪些表觀遺傳調控蛋白或復合物可提高胚胎干細胞向心肌細胞和肝細胞定向分化的效率； 2) 利用小鼠 /大鼠疾病模型，將在體外胚胎干細胞誘導分化而來的 心肌細胞和肝細胞進行移植 ，評估分化的細胞在動物體內的功能以及在動物個體發(fā)育水平和動物疾病模型中的有效性和安全性； 3) 利 用 2D 與蛋白質譜的技術分離卵母細胞激活中參與調控重編程的蛋白；研究參與重編程的重要表觀遺傳調控蛋白及復合物及在 iPS 細胞重編程中的功能；弄清這些重要表觀遺傳調控蛋白的調控網(wǎng)絡。 課題２ 干細胞定向分化與重編程中重要組蛋白修飾、染色質高級結構轉換調控和核小體組裝蛋白及復合物發(fā)揮功能的分子機制 1) 利用我們已經(jīng)建立的染色質免疫 沉淀和高通量測序的技術（ chipseq），從全基因組水平弄清胚胎干細胞向心肌細胞和肝細胞定向分化過程中重要組蛋白修飾和染色質高級結構的變化特點；重點研究異染色質結構形成的組蛋白修飾 H3K9 甲基化的調控蛋白及其結合蛋白功能復合物在胚胎干細胞向心肌細胞和肝細胞定向分化過程中的功能與調控機制； 2) 在已有的基礎上，研究調控異染色質結構向常染色質結構轉換的組蛋白乙?；揎椕?MOF 與 JMJD5 在干細胞向心肌細胞和肝細胞定向分化和重編程過程中的功能與調控機制；比較 CHD JMJD JMJD2A/2B 等在干細胞定向分化 和重編程中的調控網(wǎng)絡與規(guī)律； 3) 以在 ES 細胞分化過程中有重要作用的組蛋白 H3K27 甲基轉移酶復合物 PRC2為研究對象，研究其激活機制和拮抗機制，弄清在分化過程中 PRC2 如何實現(xiàn)H3K27 De Novo 甲基化、該修飾的蔓延又如何被限制在特定的范圍內，從而正確實現(xiàn)對其它細胞世系 (cell lineage)基因的沉默； 4) 以 ES 細胞分化過程中有重要作用的組蛋白變體 為研究對象，研究其核小體組裝和去組裝機理；對已知在 ES 細胞端粒富集的組蛋白變體 的第31 位磷酸化進行研究，尋找其催化酶及調節(jié)機理；利用蛋白 質譜技術研究組蛋白修飾在干細胞定向分化和重編程中前后的核小體上的變化特點。 課題３ 干細胞定向分化和重編程中調控組蛋白修飾、 DNA 甲基化相關蛋白質及復合物的三維結構解析 重點解析調控干細胞定向分化和重編程中涉及的組蛋白 H3K4 甲基化、 H3K9甲基化、 H3K27 甲基化和 H4K16 乙?；揎?、 DNA 甲基化修飾調控的酶和相關復合物的三維結構。對 Wdr82與 SET1 雙 RRM 結構域以及 RNA 聚合酶 II CTD 的復合物進行結構研究，闡明Wdr82 調控 SET1 酶活并偶聯(lián) H3K4 三甲基化與轉錄起始的分子機制；開展相關的 SET1 亞復合物結構研究，進一步探討 SET1 復合物促使其催化能力由單甲基化向三甲基化轉變的結構基礎；鑒定并體外重構 SET1 核心復合物，以此為基礎對該核心復合物進行結晶和晶體結構解析； 2) 研究 MOF 復合物催化 H4K16 乙?；慕Y構基礎及亞基切換改變 MOF 底物專一性的分子機制；在 已有工作的基礎上，以蛋白結晶為目的進行 MOFMSL1v1和 MOFMSL1/2/3 的結構域相互作用分析，鑒定出可以結晶的亞復合物，以此進行相關結構解析，探討 MOF 復合物底物專一性改變的分子基礎； 3) 研究 JARID2 與 PRC2 復合物結合及拮抗 H3K27 甲基轉移酶活力的分子機制；從結構的角度研究 EZH2 為什么單獨不表現(xiàn)酶活，而與 SUZ12 或 EED 形成復合物后 EZH2 甲基轉移酶活力被激活至上千倍以上。研究 AID 與 MBD4 以及 GADD45a 等 DNA 修復蛋白的相互作用，完成相關復合物的結構研究，從而揭示 AID 介導的 DNA 主動去甲基化途徑中各分子間的調控機制； 5) WICH 復合物的結構與功能； WICH 染色質重塑復合物亞基 WSTF 極可能參與了DNA 主動去甲基化途徑中的染色質重塑步驟，我們計劃研究 WSTF WAC 結構域和 ATP， H2AX 多肽等底物的復合物結構；研究 WSTF 的串聯(lián)的讀體結構域“ BAZWAKZPHDBromo”與組蛋白的多價態(tài)識別，以及對核小體底物的識別。得到的復合物結構將作為課題 4 中小分子化合物設計、篩選和優(yōu)化的部分工作基礎。 本課題在與課題１和２的研究組全面合作的基礎上，不僅將弄清新的表觀遺傳因子的三維結構還將整合以上三個課題的信息完成小分子化合物的設計、合成、篩選、優(yōu)化以及在干細胞定向分化和重編程中的功能驗證。 課題 4 中的基于蛋白結構與功能的小分子化合物設計、篩選與優(yōu)化為尋找一條通過非遺傳操作手段來高效誘導干細胞定向分化和 iPS 重編程提供新的思路與技術手段。本項目的完成可為影響我國人民健康的重大疾病的治療提供理論基礎和新的思路。在實際應用方面，可利用基礎理論的研究結果，設計出治療疾病的新方法。由于 iPS與其它相關學科的密切關系， iPS的研究和發(fā)展還可指導和應用到其它學科，帶動相關學科和相關生物醫(yī)學研究領域的發(fā)展。 iPS功能性差異的調控機制，并基于此機制推進促進項目其它領域發(fā)展。 iPS細胞中的突變基因，為 iPS的臨床應用克服關鍵的技術難題。地中海貧血等疾病的治療提供新方案。 20項以上。 ，促進國內外本領域交流，擴大本項目在研究領域影響，并及時發(fā)現(xiàn)項目進展過程中的問題、采用先進技術促成項目的完成。地中海貧血疾病常見突變位點：并結合分析比較的結果，為將來 iPS技術臨床應用必須解決的兩個關鍵問題，如何安全高效獲得 iPS和 iPS的高效定向分化，結合團隊優(yōu)勢，分別探索建立安全高效的人 iPS技術和 iPS細胞向造血細胞的高效定向分化技術，為最終的臨床治療提供依據(jù)。 2 首次明確提出并證實 iPS存在免疫原性并獲得其發(fā)生的機制。此外，基質微環(huán)境對 iPS細胞在重編程和再分化過程的影響以及免疫原性變化的作用同樣是國內外 iPS細胞研究尚未涉及的領域，該方面的研究 不僅為 iPS細胞移植安全進入臨床治療階段提供新思路和新方法，而且其理論方面的突破必將為腫瘤等重大疾病的發(fā)病基質和臨床治療提供新的理論依據(jù)。地中海貧血疾病常見突變位點修復技術，首次提出使用安全性高的 SSO技術在 iPS細胞誘導過程中修復 iPS細胞的基因突變，為點突變的遺傳疾病治療提供新的治療手段；并借助 iPS細胞誘導過程中表觀遺傳學的改變和iPS細胞的干細胞特性提高 SSO的修復效率和解決 SSO修復細胞后的增殖問題； 并為 223。 4 結合 iPS細胞臨床應用的關鍵問題：安全獲得 iPS和高效定向分化，本課題將結合自身在 iPS技術方面的優(yōu)勢，改進并突破現(xiàn)有非病毒 iPS誘導體系，建立安全高效的人 iPS誘導技術；首次通過建立造血報告基因 iPS細胞，建立篩選誘導造血分化化合物和支撐細胞，利用全新的體系建立全新人 iPS造血分化技術。而針對不同來源 iPS同異和重編程過程中的免疫原性變化研究，這兩個臨床應用必須回答的問題，國際上并無系統(tǒng)研究的報道，申報團隊在國內最早開始 iPS研究，并在免疫學和基因定點修復方面有非常強的實力，對此問題的深入研究將取得重要的突破性進展。 一方面按照遺傳信息流由 DNAmRNA蛋白質的順序，從三個層面來研究表觀遺傳對 iPS細胞免疫原性改變的影響；另一方面根據(jù)機體生物行為整體性的特點，從環(huán)境的角度研究基質微環(huán)境對 iPS細胞在重編程和再分化過程的影響以及免疫原性變化的作用，并探索其具體調控機制。地中海貧血疾病常見突變位點的修復技術。 可行性分析： 1 立項依據(jù)充分： 目前對于 iPS重編程的研究主要集中在如何高效建立重編程和重編程的機理上，雖然 iPS技術不斷得到改進， iPS技術的安全性 也得到了很大的改善，小鼠iPS也通過四倍體實驗證明了其與胚胎干細胞的相似性，但人 iPS細胞在走向臨床應用之前，尚有一系列必須得到回答的問題仍未有答案，這就是通過不同方法、不同組織細胞甚至是不同疾病患者來源獲得的人 iPS細胞，它們之間是否有區(qū)別，是否帶有來源組織的表觀遺傳記憶？它們與人胚胎干細胞是否真的非常相似？它們在分化的時候是否因此會有區(qū)別？這種差異性是如何調控的？其確切的機制如何 ?對于以上問題的解答，將可能在 iPS重編程機制研究方面取得重要的突破，為其應用提供理論基礎。 2 具有良好的工作基礎： 本課題的承擔實驗室包括中科院再生生物學重點實驗室、醫(yī)學免疫學國家重點實驗室和醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，在國內最早開展 iPS研究，建立了成熟的人 iPS誘導體系，并已經(jīng)建立多種組織和疾病來源的 iPS細胞株；具有非常完善的免疫學研究手段和數(shù)十年的免疫學研究經(jīng)驗；在國內最早開始基因定點修復研究，能夠很好