【正文】 而還存在易被病毒突變逃逸、潛在細(xì)胞毒性、藥代特性等方面問題有待改進(jìn)。此非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)也參與若干細(xì)胞過程，比如干擾素抵抗以及凋亡調(diào)節(jié)。目前還沒發(fā)現(xiàn) NS5A 的 酶功能，研究顯示 NS5A 可能通過與其它的 HCV蛋白或宿主細(xì)胞因子相互作用來發(fā)揮功能。區(qū) 域二（ 250342 殘基）起著調(diào)節(jié)的功能，比如和蛋白激酶 PKR、 PI3K 以及 NS5B 相作用，并且，此區(qū)域也包含 IFN 敏感性決定區(qū)。 并且，此組裝作用就是通過區(qū)域里的磷酸化作用調(diào)節(jié)的。而抗NS5A 抑制劑的突變位點(diǎn)也在 NS5A 的氨基端附近，位于蛋白和膜之間，表明抑制劑可能就結(jié)合在二聚體結(jié)合 面。 區(qū)域一的分子表面， A、 C 兩圖顯示 區(qū)域一的表面電勢(shì) ， 以不同顏色表示，紅色為酸性，白色為中性， 藍(lán)色為 堿性。 19 圖三、 NS5A 區(qū)域一的二聚體 結(jié)構(gòu) 。 B） 二聚體表面電勢(shì)分布。 C） NS5A 結(jié)構(gòu)相對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的位置。 NS5A 抑制劑的代表性化合物是 BMS790052， 已經(jīng)進(jìn)入 3 期臨床， 結(jié)構(gòu)如下圖，其初步構(gòu)效關(guān)系已被報(bào)道 3。 目前 研發(fā)較深入的 NS5A 抑制劑 總結(jié) 見表一，大部分化合物的結(jié)構(gòu)沒有披露，但根據(jù)其專利信息，可以發(fā)現(xiàn)都是 BMS790052 的結(jié)構(gòu)類似物。D IRELAND 5 NT 四、 BMS790052(daclatasvir)研究 ： 、 BMS790052 部分活性數(shù)據(jù)： 表三、代表性 NS5A 抑制劑 BMS790052 活性數(shù)據(jù) 項(xiàng)目 數(shù)值 項(xiàng)目 數(shù)值 HCV replicon (pM) EC50 177。 t1/2 (min)(HLM) Elimination rate constant (k) Cytotoxicity, CC50 (μM) PBM 19 Cytotoxicity, CC50 (μM) Vero 21 Cytotoxicity, CC50 (μM) CEM CLint(μL/min/mg protein) CYP1A2 (μM) IC50 100 CYP1A2 (μM) IC90 100 CYP3A4 (μM) IC50 177。 CYP2C9 (μM) IC90 100 Resistance Mutations L31 V 、 BMS790052 的結(jié)合位點(diǎn)： BMS790052 的結(jié)合位點(diǎn)還未見報(bào)道，但其類似物 BMS411 的可能結(jié)合位點(diǎn)已被披露 4。 BMS411 與 NS5A 蛋白二聚體結(jié)合模式預(yù)測(cè)圖，黃色棒球 部分代表高耐藥突變殘基。 片段 I 的構(gòu)效關(guān)系 3c： 片段 I 被相當(dāng)密集的考察過， 在通向 BMS790052 的道路中，對(duì)此部分的考察 是通過下面化合物 1 進(jìn)行的： 24 通過此部分考察發(fā)現(xiàn)此核心結(jié)構(gòu)的平面性、指向、極性、長度都活性影響很大。而延長飽和烷基鏈的鏈長，活性降低程度中等。 同時(shí)，雜芳環(huán)的引入也使得某些化合物具備了對(duì) GT1a 的中等程度的抑制活性。 結(jié)果顯示，縮短此結(jié)構(gòu)長度 使活性極大降低，而增加長度至三個(gè)苯環(huán)活性基本保持，而毒性下降。 片段 II 和片段 III 的構(gòu)效關(guān)系 6： 在片段 II 的咪唑 4位引入噻吩、呋喃或苯基導(dǎo)致活性下降，但引入小基團(tuán)如氟、氯、溴等后 ， EC50 基本不變， 而 EC90 有中等程度提高 。在片段 III 上的取代也表現(xiàn)出類似趨勢(shì)，小體積的疊氮取代活性 基本 保持，并且 （ 4R） 疊氮取代 在 PBM、 CEm和 Vero 細(xì)胞中沒有表現(xiàn)出任何毒性（ 100μM） ，（ 4S） 疊氮取代表現(xiàn)出毒性（略） 。 將兩個(gè)位置最優(yōu)取代結(jié)合，得到化合物活性都能保持，并且發(fā)現(xiàn)咪唑溴代的疊氮產(chǎn)物在 Vero 細(xì)胞上無毒 性（ 100μM）。 片段 IV 的構(gòu)效關(guān)系 3d, e： 在此處的改造主要為提高在 GT1a 上的抑制活性，對(duì)此部分的考察 是通過下面化合物 3 進(jìn)行的： 首先發(fā)現(xiàn)， 去除乙基， 在 GT1a 上的活性降低，但兩個(gè)化合物 苯甲酰胺和苯胺 環(huán)的二面角 大小 基本 相同 ，說明原化合物的 GT1a 上活性的提高不是鄰位取代引起的空間 效應(yīng) 所致 。基于此，對(duì)一系列含氮雜環(huán)進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)異喹啉甲酰胺表現(xiàn)出與原來預(yù)測(cè)相一致的活性，即：其結(jié)構(gòu)是有 GT1b 高活性的苯乙酸和有 GT1a 高活性的苯甲酸的融合，而確實(shí)兼具了兩者的優(yōu)勢(shì)，如下圖所示， 鑒于此，對(duì)此類結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)考察，主要考察取代基的影響，發(fā)現(xiàn) 取代基效應(yīng)非常明顯，兵器最終得到了雙取代化合物 30（結(jié)構(gòu)略），不僅在 GT1 兩個(gè)亞型上表現(xiàn)強(qiáng)的抑制活性，在 G2a JFH（ EC50 = nM）、 G2a NIH（ EC50 = 14nM）、G3a（ EC50 = nM）和 G5a hybrid（ EC50 = nM）也表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制活性。而比較 30 與化合物 3 苯甲酰胺和苯胺環(huán)的構(gòu)想， 發(fā)現(xiàn)相差很大，推測(cè)，可能化合物 3 的構(gòu)象與 NS5A GT1b的生物構(gòu)象較符合，而 30 則與 NS5A GT1a 的較符合。 進(jìn)一步考察中為避免烯烴順反互變帶來的影響，將烯烴置換為炔鍵，主要進(jìn)行甘氨酸類 多樣性考察 : 發(fā)現(xiàn)此處化合物活性隨著取代基堿性的減弱而降低，并得到活性進(jìn)一步提高的化合物 。 據(jù)此， 我們初步設(shè)計(jì)以 了第一階段工作計(jì)劃，先合成以 下幾種 Linker/Core 的化合物，之后再選擇活性較好的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步環(huán)以及氨基酸部分改造 ： 并 三 環(huán)類 : 四元環(huán)類： 28 其它類： 29 參考文獻(xiàn)： 1. 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Bioanic amp。 Zhou, L.。 Shi, J.。 Tao, S.。 Tharnish, P.。 Coats, S.。 medicinal chemistry letters 2020, 22 (14), 48644868. 31 第三章 TLR7 激動(dòng)劑研究與設(shè)計(jì) 一、 目前已開發(fā)的激動(dòng)劑 主要參考文獻(xiàn)來自 2020 與 2020 年的兩篇綜述 7。 、 咪唑喹啉胺（ imidazoquinoline amine）類 咪喹莫德（ Imiquimod）在 1980 年代由 3M Pharmaceuticals 公司前身 Riker Laboratories 作為抗菌劑開發(fā)， 1997 年被批準(zhǔn)用作治療局部 乳頭狀瘤病毒感染 。它們的結(jié)構(gòu)下圖所示： 咪喹莫德是 TLR7 的選擇性激動(dòng)劑，但有報(bào)道其 有強(qiáng)烈催吐副作用 8。以，每周兩次，連續(xù)四周，在此計(jì)量水平下化合物能被很好的耐受，但是沒有表現(xiàn)出有意義的病毒載量和顯著的系統(tǒng)性細(xì)胞因子和生物標(biāo)記物水平的改變。隨著 Pfizer 將重點(diǎn)集中于 Coley 的寡核苷酸