【正文】 對環(huán)境造成極大的污染 [2]。 對纖維素酶產(chǎn)生菌的研究過去多集中于真菌的研究和應(yīng)用，鑒于細菌繁殖和產(chǎn)酶速度快、發(fā)酵周期短，有利于工業(yè)生產(chǎn)，故近年來對細菌產(chǎn)纖維素酶日益引起重視。據(jù)估計，纖維素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相應(yīng)水解所需的酶蛋白多 100 倍，這是影響纖維素酶實際應(yīng)用的重要原因之一 [5]。 本試驗針對酒糟生物質(zhì)降解慢的難題，擬從茅臺酒廠提供的樣品中分離細菌，篩選出酶活性較高的纖維素細菌菌株，對篩選的菌株進行產(chǎn)酶特性初步研究，以此為依據(jù) 優(yōu)化產(chǎn)酶條件，以期為酒糟綜合利用研究提供科學(xué)依據(jù)。 酶活較強的菌種有纖維桿菌屬 (Culmolnoas)、生孢纖維菌屬 (sporocytophaga)[7]和梭菌屬 (cellulomonas)。根據(jù)細菌的生理學(xué)特性，一般將纖維素降解細菌分類為：厭氧型、好氧型和好氧滑動菌。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 2 頁 厭氧細菌將 3 種纖維素酶 以特定方式 聯(lián)合組裝成一個大復(fù)合體 — 纖維小體(cenulosome)[10]，具有多種功能的超分子結(jié)構(gòu)。研究表明，細菌在降解纖維素過程中產(chǎn)生纖維素酶的量較少，且大多不能分泌到細菌細胞外，其大多數(shù)對結(jié)晶纖維素沒有活性， 在降解纖維素 能力 方面，細菌 明顯低于真菌，因此 ， 很少將細菌投入到工業(yè)生產(chǎn)中 [11]。纖維素酶和濾紙酶活研究結(jié)果表明，這 5 株菌在分泌纖維素酶活力及降解濾紙能力方面均較強，其分解纖維素的酶活最高達到 U/ mL，而分解濾紙的酶活力則最高達到 64 U/ mL。C 。 李日強等 [12]通過對發(fā)酵處理后的玉米秸稈和白酒糟的分析，玉米秸稈經(jīng)發(fā)酵處理后粗蛋白、真蛋白和主要氨基酸總量分別比發(fā)酵處理前高了 %， %和 %；白酒糟經(jīng)發(fā)酵處理后粗蛋白、真蛋白和主要氨基酸總量分別比發(fā)酵處理前高了 %， %和 %，而且都具有較高的半纖維素酶和纖維素酶活性，可對秸稈和白酒糟進行持續(xù)降解，進一步提高了消化率。C 的水浴鍋中保持 5 h，可以提高還原糖的含量，殘 糟發(fā)酵酒精度達到 %vol，出酒率達到 %，出酒率比原糟提高了 %，蒸餾出的產(chǎn)品達到蒸餾白酒各項衛(wèi)生指標，達到優(yōu)質(zhì)醬香白酒的要求，提高了醬香型白酒酒糟的利用價值。 酒糟的利用研究也有進展，歸納起來，主要是通過生物法，將酒糟發(fā)酵為動物飼料，或從中再提取酒精，再有就是發(fā)酵為有機肥這幾大個方面，并從其中衍生出其他的發(fā)展方向。 平均海拔高度 880 m，年平均氣溫 176。茅臺鎮(zhèn)地處河谷，風(fēng)速小，冬暖、夏熱、少雨、少風(fēng)的特殊小氣候十分有利于釀造茅臺酒 微生物 的棲息和繁殖。 采集的樣品放入塑料袋中，封口，置于冰箱中 4176。 樣品基本理化性質(zhì) 表 為茅臺酒廠提供的酒糟、 301 車間酒糟、酒曲、酒醅、茅臺有機高粱基地土壤、廢舊稻草等樣品的基本理化性質(zhì)。 表 樣品基本理化性質(zhì) 樣品名稱 含水率 有機 C 有機質(zhì) pH 全 K 速效 K 全 P 全 N 堿解 N % g/kg g/kg mg/kg mg/kg % g/kg mg/km 茅臺酒糟 301 車間酒糟 茅臺大曲 茅臺酒醅 1 茅臺有機高粱基地土壤 廢舊稻草 小麥粉 里村組土壤 里列組土壤 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 4 頁 研究內(nèi)容和技術(shù)路線 主要研究內(nèi)容 1．試驗在 30176。C 培養(yǎng)條件下，從茅臺酒丟糟、 301 車間丟糟、酒曲、酒醅、茅臺有機高粱基地土壤、廢舊稻草樣品中分離細菌； 2．對分離得到的菌株分別于 30176。C 下，采用羧甲基纖維素鈉鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)基進行初篩； 3．對初篩得到的菌株進行 生長曲線的測繪，以及 濾紙酶活力（ FPA） 、 羧甲基纖維素鈉酶活力（ CMC）的 測定，篩選出纖 維素酶酶活性最高的菌株保存。 2．羧甲基纖維素鈉鑒定培養(yǎng)基（ CMCNa） [14]：羧甲基纖維素鈉 g、蛋白胨 g 、 K2HPO47H2O g、 NaNO3 g、 KCl g、瓊脂 g、蒸餾水 ，調(diào) pH 。 4．斜面保存培養(yǎng)基：牛肉膏 g、蛋白胨 g、 NaCl g、蒸餾水 mL，調(diào) pH 。 6．纖維素分解細菌活化培養(yǎng)液：羧甲基纖維素鈉 g、蛋白胨 g、酵母膏 g、 K2HPO47H2O g、 NaCl g、蒸餾水 mL、調(diào) pH 。7H2O g、 CaCl2 g、 K2HPO4 6H2O g、蒸餾水 mL、調(diào) pH 。C 下，滅菌 30 min 后使用。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 6 頁 2．檸檬酸緩沖液：稱取 4. 2 g 檸檬酸溶于 200 .0 mL 蒸餾水，配成 0. 1 mol / L 檸檬酸溶液，稱取 5. 88 g 檸檬酸三鈉溶于 mL蒸餾水，配成 0. 1 mol/ L檸檬酸三鈉溶液。量取 0. 1 mo l/ L檸檬酸溶液 57 mL， 0. 1 mol / L 檸檬酸三鈉溶液 mL，再量取 mL蒸餾水 混勻，配成 pH4. 0. 05 mol / L 的檸檬酸緩沖液。 4． CMCNa 溶液：稱取 g CMCNa（羧甲基纖維素鈉）溶于 mL醋酸緩沖液（ pH ），加熱使之溶解，保存于冰箱中，以待使用。C 烘箱中烘 2 h 至恒重，稱取 g 烘好的葡糖糖，溶解并定容至 mL。再用 2 % NaHCO3洗至中性，曬干待用。 主要儀器 儀器名稱 型號 生產(chǎn)廠商 冰箱 BCD215KALM 青島海爾股份有限公司 電熱恒溫培養(yǎng)箱 DH6000BH 天津市泰斯特儀器有限公司 電子天平 ALB224 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司 單人單面凈化工作臺 SW— CJ— 1FD 蘇州凈化設(shè)備有限公司 恒溫振蕩器 ZD— 85A 常州澳華儀器有限公司 型電熱鼓風(fēng)干燥箱 101— 2AB 天津市泰斯特儀器有限公司 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 DHG— 9240 上海一恒科技有限公司 紫外可見分光光度計 721GG 上海儀電分析儀器有限公司 高速臺式離心機 TGL— 16B 上海安亭科學(xué)儀器廠 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 7 頁 方法 分離、純化 將從貴州茅臺酒廠取樣到的樣品搗碎后，取適量濾液接 取 g樣品于 mL無菌水中制備成 1%的菌懸液，震蕩培養(yǎng) 30 min用無菌蒸餾水稀釋 10 1010 105四個梯度，然后再用無菌吸管吸取 100 μL菌懸液滴入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上涂布均勻，分別在 30 176。C 恒溫培養(yǎng)箱中 倒置 培養(yǎng) 2 d，不同處理均作 3個重復(fù)。觀察牛肉膏蛋白胨各培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)特征，拍照并作好詳細記錄 。 分別于 30176。C 下 倒置 培養(yǎng) 2 d，每天檢測觀察各菌株的菌落狀況，最后通過滴加革蘭氏碘液， 靜置 10 min，傾去染液，將平板置于白色背景下，觀察透明圈產(chǎn)生的清晰度， 測量菌落及淺色透明圈半徑（ R， mm），并拍照記錄 。 最后保存菌落半徑與透明圈比值大于 2： 4的菌株于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上，其活性與透明圈半徑 /菌落半徑（ R/r）在冰箱中 4176。 細菌生長曲線的測定 從斜面保存培養(yǎng)基挑取菌株單菌落，置于盛有 mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中，振蕩培養(yǎng) 12 h，然后取 100 μL 菌懸液置入另外盛有 10 mL LB 液體培養(yǎng)液的試管中振蕩培養(yǎng)。 以未接種的LB培養(yǎng)液做空白對照，依次測定。 然后以時間為橫坐標，以 OD值 為縱坐標，繪制菌體生長曲線。 另取試管 7 支，編號，用移液管準確吸取上述試管個濃度的標準葡萄糖溶液 mL，對好加入各試管，然后于各試管中加入 DNS 試劑 mL，搖勻，置于沸水中煮沸 5 min。選用 520 nm 波長。以 mL 蒸餾水代替葡萄糖標準液按同樣顯色操作為空白調(diào)零點。 根據(jù) DNS (3， 5二硝基水楊酸 )比色法測定原理繪制葡萄糖標準曲線 [16]。C 通過靜置培養(yǎng) 、 50176。 每 24 h 取一次菌液， 3500 r/min 下離心 5 min，收集上清液用于測定酶活。C 恒溫水浴中反應(yīng) 30 min，加入 mL DNS 試劑，沸水浴 10 min，冷卻后定容至 mL。 3．濾紙崩解 的測定 分別用接種環(huán)取一環(huán) 初篩得到的菌種，將其接種到 裝有 10 mL濾紙培養(yǎng)液 的10mL試管 中， 置于 30176。C 恒溫搖床， 120 r /min下振蕩培養(yǎng)， 每天檢查記錄各菌株對濾紙的作用 情況 [17]。具體表示： +濾紙邊緣膨脹； + + 濾紙整齊膨脹并下彎； + + + 濾紙不定形； + + + + 全成糊狀。 4． CMC 酶活力測定 酶液的稀釋：取大號試管 13 只，用移液管吸取離心后的酶 1 mL，加水 24 mL，搖勻。每次測酶活時均設(shè)一個總的空白樣，即在試管中不加底物和酶液，只加蒸餾水 mL，用作測量 吸光度 時的參比。 在容積為 10 mL的試管管中，加入 1 mL 適當稀釋的酶液于 50176。C 恒溫水浴中預(yù)熱 5 min 后， 搖勻，將試管置于水浴鍋中， 50176。將試管從水浴鍋取出后，往所有試管中加入 mL DNS 試劑，然后 又放入水浴鍋，沸水浴 5 min。在 560 nm 波長處測 吸光度 并做好記錄。C 下，每 1 g 纖維素酶曲在 1 min 內(nèi)水解 CMC，生成 1 ug 葡萄糖的酶活性稱作纖維素酶活力單位 ， 記作 U。 貴 貴州大學(xué)本科畢業(yè)論文（設(shè)計） 第 10 頁 3 結(jié)果與分析 分離、純化結(jié)果 利用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，分 10 10 10 105四個 不同稀釋梯度，2至 3組平行，從 茅臺酒丟糟、 301車間丟糟、酒曲、酒醅、茅臺有機高粱基地土壤、廢舊稻草樣品中初步分離 到近千個菌株，在觀察菌落生長狀況、菌落形態(tài)特征的同時， 如表 。 表 菌落計數(shù)統(tǒng)計 菌株編號 稀釋 102（計數(shù)） 稀釋 103（計數(shù) ） 稀釋 104（計數(shù) ） 稀釋 105（計數(shù)） 茅臺酒糟 B1 200328 2442 48 301 車間酒糟 B2 400 以上 105142 3454 713 茅臺大曲 B3 700 以上 74108 3238 414 茅臺酒醅 B4 124165 1722 411 茅臺有機高粱基地土壤 B5 500 以上 201274 3456 817 廢舊稻草 B6 連片 連片