【正文】 時間，以時間 T 表示〕 積分得： T ＝ ㏑ 2 ∕μ (時間 T表示細胞比生長 速率 ) 此時期細胞以指數(shù)形式增長繁殖。 第二十二頁，共一百一十二頁。 細胞數(shù)不增加，但代謝還是活潑的。 最高分裂次數(shù)限制：正常細胞都有，腫瘤〔癌〕細 胞沒有。 細胞濃度的對數(shù) 潛伏期 對數(shù)生長期 穩(wěn)定期 衰亡期 0 24 48 72 96 120 h 每代〔群體〕細胞生長的四個時期 第二十四頁，共一百一十二頁。 體外培養(yǎng)的特點 動物細胞營養(yǎng)需求苛刻：氨基酸〔細胞是不能自 主合成必須氨基酸的〕、單糖〔能源；合成某些氨基 酸、脂肪、核酸的原料〕、維生素〔輔酶、輔基〕、 其他大量和微量元素、促生長因子和激素〔促進細胞 生長、維持細胞功能、保持細胞分化和未分化狀態(tài)〕 培養(yǎng)環(huán)境條件要求嚴(yán)格：溫度、滲透壓〔多數(shù) 哺乳動物細胞 260~320mOsm∕kg〕、 pH〔及溶氧量 CO2和 HO〕的相對恒定、剪切力等。 第二十六頁，共一百一十二頁。 培養(yǎng)條件和工具 一、培養(yǎng)條件： 溫度：多數(shù)哺乳動物 37℃ ，偏離那么影響代謝和 生長。 pH：最適 ~，低于 高于 至死亡。 O2 ？ CO2 ？ CO2培養(yǎng)箱？ 營養(yǎng)：需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生長因子。 培養(yǎng)條件 —— 培養(yǎng)基 1. 天然培養(yǎng)基〔 natural medium〕：來自動物體液 或組織別離提取的培養(yǎng)基。 〔 1〕血清：主要為?！蔡ヅ?、新生牛、小?！?、 馬、雞、兔、羊、人血清。含各種血漿蛋 白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生長因子及無 機物等，在生理平衡下促進或抑制細胞生長。 第二十九頁，共一百一十二頁。 〔 3〕雞胚浸出液：含生長因子、核蛋白、氨基 酸等，刺激細胞生長。用于原代和 細胞系的培養(yǎng)。 培養(yǎng)條件 —— 培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基〔 synthetic medium〕：給細胞提供近 似體內(nèi)的生理環(huán)境，且便于控制和標(biāo)準(zhǔn)化。 使用時需加天然培養(yǎng)基。也稱通用培養(yǎng)基〔可用于 許多細胞〕。現(xiàn)已有幾 十種，用途不同。 培養(yǎng)條件 —— 培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基： 〔 2〕無血清培養(yǎng)基〔 serun free medium,SFM〕： 化學(xué)限定性培養(yǎng)基或化學(xué)成清楚確培養(yǎng)基〔 chemical defined medium)。在根底理論研究中 血清的使用影響實驗結(jié)果〔原因與結(jié)果難以對應(yīng)〕。 第三十二頁，共一百一十二頁。如纖連蛋白〔 FN〕，層粘連蛋白〔 LN〕 等。 〔 2〕促生長因子與激素： 〔 3〕酶抑制劑：如大豆胰酶抑制劑。 第三十三頁，共一百一十二頁。 組織消化培養(yǎng) 〔 1〕取材、別離、消化 消化軟組織： %胰蛋白酶 消化纖維組織： 消化傳代細胞〔制成細胞懸液〕： EDTA+胰蛋白酶 第三十四頁，共一百一十二頁。 傳代培養(yǎng)： 原代細胞分裂增殖成片，布滿器皿外表時，那么需 對其別離進行重新培養(yǎng)。 ：敏感 /遲鈍 〔酶作用時間和方法，細胞的類型和來源〕 第三十五頁，共一百一十二頁。 〔 1〕玻璃：明礬 —— 硅硼膠玻璃。 〔 3〕金屬：不銹鋼和肽。 貼壁培養(yǎng)的生長特性 游離期： 接種的細胞，懸浮，細質(zhì)回縮變圓。貼壁 快：單個細胞，傳代細胞；貼壁慢：組織快，較大細 胞團；不利于細胞貼壁的：細胞狀態(tài)不好，培養(yǎng)基 pH 不正常，培養(yǎng)瓶不潔。經(jīng)一段停滯，開始分 裂。 退化期： 細胞長滿培養(yǎng)瓶壁達一定密度，隨著營 養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，細胞開始退化。 動物細胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法 ?懸滴培養(yǎng)法 ?旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 ?灌注小室培養(yǎng)法 ?培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 ?培養(yǎng)板培養(yǎng)法 第三十八頁，共一百一十二頁。是最早 的傳統(tǒng)技術(shù)〔 1907年 Harrison創(chuàng)立〕。 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法： 1933~1934年 Gey 和 Lewis建立管 狀培養(yǎng)器皿固定于旋轉(zhuǎn)裝置上旋轉(zhuǎn)， 培養(yǎng)物接種于器 皿 中培養(yǎng)。 缺點： 旋轉(zhuǎn)管不易在顯微鏡下觀察。 第四十頁，共一百一十二頁。載玻片 —— 上下 壁，金屬圈 —— 側(cè)壁，密封成小 室，其側(cè)面有液體流入和流出口。 后來的許多大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)在設(shè)計上都參考了此 方法的原理。 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：培養(yǎng)物直接接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)，在放 入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 與此相關(guān)的方法：載玻片加培養(yǎng)瓶法。 第四十二頁，共一百一十二頁。曾叫微量培養(yǎng)法，是最常用 的體外培養(yǎng)技術(shù)方法。 第四十三頁，共一百一十二頁。包 括懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中空纖維 法、微多孔載體培養(yǎng)等。 懸浮培養(yǎng)技術(shù) 少數(shù)動物細胞屬于懸浮生長型，離體培養(yǎng)時 不需附著物，只需懸浮于培養(yǎng)液中就可以良好 生長。 第四十五頁，共一百一十二頁。 微載體培養(yǎng)技術(shù) 最初在培養(yǎng)液中加小滾瓶增加貼壁細胞的生長面 積，此法構(gòu)造簡單，本錢低，重復(fù)性好，簡單易行。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細胞技術(shù) (Van Wezel,1967): 一定程度上改變了其缺乏、最初的載體為離子交換樹 脂微珠〔 60~250微米〕。 第四十七頁，共一百一十二頁。 微囊化培養(yǎng)技術(shù) 將細胞包裹在微囊中進行懸浮培養(yǎng)。 20世紀(jì) 80年代初〔 Lim和 Sum〕制成了細胞能在其 中生長的微囊。 第四十九頁，共一百一十二頁。 最初由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的半透膜， 外表有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，構(gòu)成動物細胞生存的立 體三維空間〔類似于毛細血管〕。別離純化細胞分泌物極其方便。 第五十頁，共一百一十二頁。 微多孔載體培養(yǎng)：克服了其缺乏。 優(yōu)點：降低血清用量、易固定化、比外表積大、細 胞免受機械損傷、適合于懸浮細胞的固定化連續(xù)灌流 培養(yǎng)、也適合于大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。 微多孔載體培養(yǎng)技術(shù) 微多孔載體的制作材料：生物相容性〔無毒、黏 附細胞〕、機械穩(wěn)定性〔保證長期攪拌不破粹和清洗 處理回收利用〕、熱穩(wěn)定性〔高溫高壓滅菌不分解、 不破粹、不軟化〕要好。 第五十二頁，共一百一十二頁。 微多孔載體的制備方法 材料不同、制備方法不同。 高嶺土、云母〔成孔材料〕、礬土、氫氧化鋁、 二氧化硅 → 碾細混勻，加甲基醋酸纖維素 → 漿液 → 擠壓 → 球狀顆粒 → 枯燥 →1000 ℃ 燒結(jié)幾小時 → 陶 瓷小顆粒 →1400 ℃ → 熔化云母 → 多孔陶瓷載體。 微多孔載體的制備方法 2. 高分子材料成球聚和法： 水〔懸浮分散介質(zhì)〕加分散劑，強力攪拌 → 不溶 于水的單體分散成小液珠 → 加引發(fā)劑〔油溶性〕 → 成 珠狀小球 →100~105 ℃ 去除未反響的單體和成孔物質(zhì) → 稀酸清洗夾在微球中的分散劑 → 多孔微球 → 氧化劑 處理使其外表極化 → 親水的多孔載體。 微多孔載體的制備方法 ： 海藻酸鈉溶液在氯化鈣溶液 中快速凝聚成球。 第五十六頁，共一百一十二頁。 第五十七頁，共一百一十二頁。因為動物細胞沒有細胞壁、非常脆弱、對剪切 敏感、對培養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格。但其結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣 升式、固定床為主。 第五十八頁，共一百一十二頁。 利用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)具有獨特的 作用和意義，也是植物、微生物細胞培養(yǎng)所無法替代 的。 動物細胞能精確地轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工較大或更復(fù)雜的 蛋白質(zhì)〔特別是加工蛋白質(zhì)的環(huán)境、過程、結(jié)果等是 植物微生物細胞極少有的〕；能將目的蛋白分泌到培 養(yǎng)液中，從而簡化了蛋白質(zhì)的別離、純化。 動物細胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 二、應(yīng)用：目前動物細胞生物反響器培養(yǎng)生產(chǎn)的生物 制品主要類型： 病毒疫苗：如乙肝疫苗〔 HbsAg〕、脊髓灰質(zhì)炎 疫苗〔 Polio〕、狂犬疫苗〔 Rabies〕等； 非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：如干擾素〔 IFN〕、白細胞 介素〔 IL〕、 B細胞生長因子〔 BCGF〕、巨噬細胞激 活因子〔 MAN〕、 T細胞替代因子 (TRF)等。 第六十頁，共一百一十二頁。 腫瘤特異性抗原：癌胚抗原〔 CEA〕等； 單克隆抗體〔 MCAB〕； 病毒殺蟲劑：桿狀病毒等。 動物細胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 三、關(guān)鍵技術(shù) 〔一〕細胞培養(yǎng)環(huán)境 〔二〕細胞死亡與凋亡 〔三〕培養(yǎng)基與細胞系 〔四〕過程監(jiān)控 第六十二頁，共一百一十二頁。氨的積聚〔來源于培養(yǎng)基和細胞的代謝〕使細 胞內(nèi) UDP氨基己糖增加，影響細胞的生長和蛋白質(zhì)糖基化過 程。 乳酸：糖代謝產(chǎn)物。因此應(yīng)減少培養(yǎng)基中葡萄糖的濃 度〔以減少乳酸〕同時平衡葡萄糖與 Gln的比例。 關(guān)鍵技術(shù) —— 細胞培養(yǎng)環(huán)境： 二氧化碳： CO2 累積改變 細胞代謝水平、對細胞產(chǎn)生 毒性。 甲基乙二醛〔 MG)：為丙糖磷酸去磷酸基〔主要〕、 脂類、氨基酸代謝產(chǎn)物。 MG能改變氨基 酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基和巰基。加小牛血清可降低 MG的濃度。 關(guān)鍵技術(shù) —— 細胞培養(yǎng)環(huán)境： 滲透壓：高滲透壓提高細胞生產(chǎn)抗體的濃度、影響對數(shù) 生長期長短、細胞死亡速度。 載體：用多孔微載體替代常規(guī)載體〔細胞易受機械攪拌和噴氣損傷〕。 動物細胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 〔二〕細胞死亡與凋亡： 細胞系在生物反響器中死亡主要是細胞凋亡?？赏ㄟ^基因工程方法將 bel2這種抑 制細胞調(diào)亡的基因?qū)爰毎? 第六十六頁，共一百一十二頁。無血清培養(yǎng)基：防止了血清的批次、質(zhì) 量、成分等對細胞培養(yǎng)的污染、毒性作用、不利于產(chǎn) 品純化等不良影響。 第六十七頁，共一百一十二頁。 離線測定：需要時間長，來不及指導(dǎo)控制有關(guān)參數(shù) 和培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化、頻繁取樣易污染和增加費用。 重要〔有效〕參數(shù)：溫度、 pH、溶解氧濃度。 動物細胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 動物細胞培養(yǎng)工程目前存在的問題： ，產(chǎn)物濃度低。 、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。 ，限制