【正文】 run free medium,SFM〕： 化學限定性培養(yǎng)基或化學成清楚確培養(yǎng)基〔 chemical defined medium)。 〔 2〕促生長因子與激素： 〔 3〕酶抑制劑：如大豆胰酶抑制劑。 ：敏感 /遲鈍 〔酶作用時間和方法，細胞的類型和來源〕 第三十五頁，共一百一十二頁。貼壁 快：單個細胞，傳代細胞；貼壁慢：組織快，較大細 胞團；不利于細胞貼壁的：細胞狀態(tài)不好，培養(yǎng)基 pH 不正常，培養(yǎng)瓶不潔。是最早 的傳統(tǒng)技術(shù)〔 1907年 Harrison創(chuàng)立〕。載玻片 —— 上下 壁，金屬圈 —— 側(cè)壁，密封成小 室，其側(cè)面有液體流入和流出口。 第四十二頁，共一百一十二頁。 懸浮培養(yǎng)技術(shù) 少數(shù)動物細胞屬于懸浮生長型，離體培養(yǎng)時 不需附著物，只需懸浮于培養(yǎng)液中就可以良好 生長。 第四十七頁，共一百一十二頁。 最初由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的半透膜， 外表有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，構(gòu)成動物細胞生存的立 體三維空間〔類似于毛細血管〕。 優(yōu)點：降低血清用量、易固定化、比外表積大、細 胞免受機械損傷、適合于懸浮細胞的固定化連續(xù)灌流 培養(yǎng)、也適合于大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。 高嶺土、云母〔成孔材料〕、礬土、氫氧化鋁、 二氧化硅 → 碾細混勻，加甲基醋酸纖維素 → 漿液 → 擠壓 → 球狀顆粒 → 枯燥 →1000 ℃ 燒結(jié)幾小時 → 陶 瓷小顆粒 →1400 ℃ → 熔化云母 → 多孔陶瓷載體。 第五十七頁，共一百一十二頁。 利用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)具有獨特的 作用和意義，也是植物、微生物細胞培養(yǎng)所無法替代 的。 腫瘤特異性抗原：癌胚抗原〔 CEA〕等； 單克隆抗體〔 MCAB〕； 病毒殺蟲劑：桿狀病毒等。因此應減少培養(yǎng)基中葡萄糖的濃 度〔以減少乳酸〕同時平衡葡萄糖與 Gln的比例。加小牛血清可降低 MG的濃度。可通過基因工程方法將 bel2這種抑 制細胞調(diào)亡的基因?qū)爰毎? 離線測定：需要時間長，來不及指導控制有關參數(shù) 和培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化、頻繁取樣易污染和增加費用。 ，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)。 組織工程 概述 組織工程： 組織工程：應用細胞生物學和工程學原理，將人體的某局部組織細胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進行人工培養(yǎng)、繁殖、擴增，然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而到達器官修復或再造的治療目的的一種技術(shù)。 第七十三頁，共一百一十二頁。 第七十六頁，共一百一十二頁。 第七十八頁，共一百一十二頁。肌細胞 間有少量的結(jié)締組織、豐富的血管和神經(jīng)。 成熟的骨骼肌細胞不能進行有絲分裂。 肌肉細胞系的建立：肌細胞的連續(xù)選擇性傳代，低密度接 種到有〔或無〕飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)板上，形成單細胞克隆，可 以防止肌源性表型的過早喪失。 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) 培養(yǎng)步驟： 〔 1〕取大鼠胸、腰段脊髓，剔除脊膜，顯微鏡下別離暗灰色 組織，剪碎； 〔 2〕 37℃ %胰蛋白酶消化 15 min，胎牛血清終止酶活性 后，離心、懸浮、吹打，再離心，制得細胞懸浮液； 〔 3〕 10ml 細胞懸液于直徑 100mm培養(yǎng)皿中， 37℃ 、 5%的 CO2 孵育 2~3h，利于最大限度貼壁； 〔 4〕未貼壁的細胞離心，重新獲得細胞懸浮液，記數(shù)； 〔 5〕用多聚賴氨酸液預先包被培養(yǎng)皿〔 37℃ 〕 24h，每皿 接種 106個懸浮細胞； 〔 6〕 CO2 培養(yǎng)箱孵育 2h，換無血清化學限制培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)， 4天后換液。 開展歷史：最早 Leob〔 1897年〕進行成年兔一些器官的 嘗試性培養(yǎng) —— 血漿凝快培養(yǎng)兔的肝、腎、甲狀腺、卵巢等 〔 3天〕； 20世紀初器官培養(yǎng)進入活潑時期〔主要限于胚胎器 官〕； 20世紀 50年代進入蓬勃開展階段〔不限于胚胎器官〕， 技術(shù)、器皿、培養(yǎng)基等有了許多改進和革新。如肝、肺的一葉，一片皮膚等。 〔 3〕胚胎器官細胞生長活潑，遷移能力強，容易 從植快中遷移出來。 已成功用于研究胚胎原基的形態(tài)發(fā)生，改進后可用 于激素、維生素、致癌因子對哺乳動物成年器官的作 用等方面的研究。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 直接漂浮培養(yǎng)法： 器官浸入培養(yǎng)液中，不能持續(xù)接觸空氣〔 O2〕易 于缺氧壞死。 第九十七頁，共一百一十二頁。 優(yōu)點：可直接觀察器官的生長情況；維持器官在 體外較長時間生長、抑制細胞遷移〔瓊脂凝膠培養(yǎng)法 的優(yōu)點〕；換液簡便〔液體培養(yǎng)基的優(yōu)點〕。 第一百零一頁，共一百一十二頁。 目前，器官灌流技術(shù)應用于器官培養(yǎng)已取得了良好 效果。 第一百零五頁，共一百一十二頁。 神經(jīng)組織的器官培養(yǎng) 1985年，斯坦斯維格成功建立了大鼠胚胎腦組織的 培養(yǎng) —— 半固體瓊脂包埋靜止培養(yǎng)法。 血管的培養(yǎng) 血管醫(yī)學研究在血管發(fā)育、損傷、修復、再生等方 面具有重要意義。 肝臟的培養(yǎng)： 體外培養(yǎng)肝臟在研究肝臟生理病理過程及其機制方面有重大 意義。 第一百零九頁，共一百一十二頁。如可導 電聚合物、膀胱、〔人眼角膜細胞培育〕人造角膜。肌肉組織培養(yǎng)：肌肉組織植快或分散的肌細胞在離體環(huán)境中。 3~6層空心纖維構(gòu)成培養(yǎng)系統(tǒng)，細胞接種于空心纖。美 國密執(zhí)安大學開發(fā)生物工程人造腎。 3〕給 Conway微擴散單位裝置中央孔內(nèi)加滿培養(yǎng)液，消 毒濾紙蓋住中央孔。 1〕 —— 乙醚麻醉大鼠，消毒開胸，剪取胸動脈，培 養(yǎng)液沖洗血管內(nèi)壁，剪成 。切成小立方塊〔 〕。 4. 將股骨植塊植于培養(yǎng)管的血漿上，每隔約 15分 鐘可放入一個股骨，加塞，室溫靜止 1~2小時。 器官培養(yǎng)應用舉例 軟骨的培養(yǎng)： 軟骨培養(yǎng)常用于研究軟骨與骨的生長分化及影響因 素。 優(yōu)點： 系統(tǒng)簡單易行、可達很好的無菌效果、適 合器官的長期培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物連續(xù)收集。 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)期間，植塊斷續(xù)地與培養(yǎng)液和氣相接觸， 可獲得充足的營養(yǎng)和氧氣。 金屬格柵：堅實、平穩(wěn)、平安，支托或移動大量 的培養(yǎng)器官。 第九十六頁，共一百一十二頁。 第九十四頁，共一百一十二頁。 〔３〕器官內(nèi)部細胞遷移不明顯。 第九十頁，共一百一十二頁。 第八十九頁，共一百一十二頁。 硼酸鹽緩沖液配制的 多聚賴氨酸生長基質(zhì)，其效果好于 蒸餾水。 培養(yǎng)對象、條件、設備等不同，培養(yǎng)方法不同。〔 2〕接種在 10% CO飽和濕度 環(huán)境中培養(yǎng)。 第八十一頁，共一百一十二頁。 第七十九頁，共一百一十二頁。 上皮組織的體外培養(yǎng) 二、表皮組織的體外培養(yǎng)： 實驗材料： 表皮細胞來源： 外科手術(shù)取包皮、乳腺、腹部皮膚，流產(chǎn) 胎兒皮膚最好，燒傷的依情況定。 第七十四頁，共一百一十二頁。動物器官移植同樣 存在免疫排斥反響，且有將動物的一些病毒傳染給人類的危險 組織代用品：如硅膠、不銹鋼、金屬合金等，致命弱點 是與人體組織相容性差，不能長久使用，還易引起感染。 、細胞解離容易，并能重復使 用的新型廉價的微載體。 動物細胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 動物細胞培養(yǎng)工程目前存在的問題： ，產(chǎn)物濃度低。無血清培養(yǎng)基：防止了血清的批次、質(zhì) 量、成分等對細胞培養(yǎng)的污染、毒性作用、不利于產(chǎn) 品純化等不良影響。 載體：用多孔微載體替代常規(guī)載體〔細胞易受機械攪拌和噴氣損傷〕。 甲基乙二醛〔 MG)：為丙糖磷酸去磷酸基〔主要〕、 脂類、氨基酸代謝產(chǎn)物。氨的積聚〔來源于培養(yǎng)基和細胞的代謝〕使細 胞內(nèi) UDP氨基己糖增加，影響細胞的生長和蛋白質(zhì)糖基化過 程。 動物細胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 二、應用：目前動物細胞生物反響器培養(yǎng)生產(chǎn)的生物 制品主要類型： 病毒疫苗：如乙肝疫苗〔 HbsAg〕、脊髓灰質(zhì)炎 疫苗〔 Polio〕、狂犬疫苗〔 Rabies〕等； 非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：如干擾素〔 IFN〕、白細胞 介素〔 IL〕、 B細胞生長因子〔 BCGF〕、巨噬細胞激 活因子〔 MAN〕、 T細胞替代因子 (TRF)等。但其結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣 升式、固定床為主。 微多孔載體的制備方法 ： 海藻酸鈉溶液在氯化鈣溶液 中快速凝聚成球。 第五十二頁，共一百一十二頁。 第五十頁，共一百一十二頁。 20世紀 80年代初〔 Lim和 Sum〕制成了細胞能在其 中生長的微囊。 微載體培養(yǎng)技術(shù) 最初在培養(yǎng)液中加小滾瓶增加貼壁細胞的生長面 積，此法構(gòu)造簡單，本錢低，重復性好，簡單易行。 第四十三頁，共一百一十二頁。 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法：培養(yǎng)物直接接種在培養(yǎng)瓶內(nèi)，在放 入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 缺點： 旋轉(zhuǎn)管不易在顯微鏡下觀察。 退化期： 細胞長滿培養(yǎng)瓶壁達一定密度，隨著營 養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，細胞開始退化。 〔 3〕金屬：不銹鋼和肽。 組織消化培養(yǎng) 〔 1〕取材、別離、消化 消化軟組織： %胰蛋白酶 消化纖維組織： 消化傳代細胞〔制成細胞懸液〕： EDTA+胰蛋白酶 第三十四頁，共一百一十二頁。 第三十二頁，共一百一十二頁。也稱通用培養(yǎng)基〔可用于 許多細胞〕。 〔 3〕雞胚浸出液：含生長因子、核蛋白、氨基 酸等，刺激細胞生長。 培養(yǎng)條件 —— 培養(yǎng)基 1. 天然培養(yǎng)基〔 natural medium〕：來自動物體液 或組織別離提取的培養(yǎng)基。 第二十六頁，共一百一十二頁。 細胞數(shù)不增加，但代謝還是活潑的。 對數(shù)生長期〔 logarthmic growth phase〕： 分裂旺盛、分裂相增多〔其數(shù)量標志分裂的旺盛程 度〕。 細胞可發(fā)生自發(fā) 轉(zhuǎn)化，其標志之一：獲永久增殖能力而成連續(xù)細胞系 〔株〕。 1~4周。 但細胞密度進一步加大、營養(yǎng)減少、代謝產(chǎn)物增多 時，〔因營養(yǎng)和代謝物的影響〕細胞分裂停止，出 現(xiàn)接觸抑制。 有些細胞既可懸浮，也可以貼附。 細胞胞體略呈多角形；細胞胞突細長形；類 似絲狀偽足。胞間緊密，單層貼壁。假設取走一片細胞 ，存留的細胞就 會沿著外表生長而重新布滿外表。 第八頁，共一百一十二頁。 動物細胞的特點 〔二〕動物細胞的培養(yǎng)特點： ，無細胞壁。 ? 隨著基因重組和單克隆抗體技術(shù)的開展，動物 ? 細胞組織培養(yǎng)展現(xiàn)出越來越可觀的工業(yè)化前景。 動物細胞培養(yǎng)的奠基人：美國生物學家哈里森 〔 1907年〕用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將 蛙胚神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活幾周，有細 胞突起的生長過程。 第一頁，共一百一十二頁。 第四頁，共一百一十二