【正文】 第四章 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng) (Animal Cell and Tissue Culture) 動(dòng)物體內(nèi)取出組織和細(xì)胞，在體外模擬機(jī)體內(nèi)的生理 條件，建立無菌、適溫和一定的營(yíng)養(yǎng)條件，使之生長(zhǎng) 和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)，稱動(dòng)物細(xì)胞與 組織培養(yǎng)。 是動(dòng)物細(xì)胞工程的重要技術(shù)根底：細(xì)胞融合、組織 工程、胚胎工程、干細(xì)胞工程、動(dòng)物克隆、動(dòng)物細(xì)胞 產(chǎn)品的大規(guī)模制備技術(shù)等等都離不開～。 第一頁，共一百一十二頁。 概 述 ? 4. 開展歷史 ? 動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn) ? 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的概念 ? 動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)生長(zhǎng)特性 第二頁，共一百一十二頁。 4. 開展歷史 動(dòng)物細(xì)胞〔組織〕培養(yǎng)技術(shù)的起源： 19世紀(jì)所應(yīng)用的胚胎學(xué)技術(shù)。 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的奠基人：美國(guó)生物學(xué)家哈里森 〔 1907年〕用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將 蛙胚神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活幾周，有細(xì) 胞突起的生長(zhǎng)過程。 先驅(qū)者中法國(guó)學(xué)者卡勒爾：設(shè)計(jì)卡氏培養(yǎng)瓶自 1923年用于培養(yǎng)雞胚的心肌組織成功以后，已使 多種動(dòng)物組織培養(yǎng)獲得成功。 第三頁，共一百一十二頁。 4. 開展歷史 20世紀(jì) 40年代以后： 動(dòng)物組織培養(yǎng)的科學(xué)家們研究重點(diǎn)集中在培養(yǎng) 基方面。 20世紀(jì) 80年代以后： 隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)的迅速發(fā) 展，已能把特定的外源基因通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增幾 千倍，并可轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，使其得到高質(zhì)量的表 達(dá)。 第四頁，共一百一十二頁。 4. 開展歷史 ? 近年： ? 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，使動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入了 ? 一個(gè)新領(lǐng)域。雜交瘤細(xì)胞能在體外懸浮情況下大 ? 量繁殖并產(chǎn)生單克隆抗體。 ? 隨著基因重組和單克隆抗體技術(shù)的開展，動(dòng)物 ? 細(xì)胞組織培養(yǎng)展現(xiàn)出越來越可觀的工業(yè)化前景。 第五頁，共一百一十二頁。 動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn) 〔一〕動(dòng)物細(xì)胞之間的連接特點(diǎn)： ：牢固、無間隙。 ： 23nm間隙。 ： 2030nm間隔，有橫隔。 ： 無橫隔、透明，間隔 2030nm。 ： 有間隙，有纖維形成的特殊結(jié)構(gòu)。 第六頁，共一百一十二頁。 動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn) 〔二〕動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特點(diǎn)： ，無細(xì)胞壁。 ，生長(zhǎng)緩慢，易受污染。 ，對(duì)機(jī)械攪拌或剪切力敏感。 。 50代左右即退化死亡。 第七頁，共一百一十二頁。 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)的概念 ?動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)：從動(dòng)物體內(nèi)取出 ?細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境條件， ?在無菌、適宜溫度和豐富營(yíng)養(yǎng)條件下，使 ?離體細(xì)胞或組織生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和 ?功能的一門技術(shù)。 ?是動(dòng)物細(xì)胞工程的重要技術(shù)根底。 第八頁，共一百一十二頁。 貼附和非貼附生長(zhǎng)： ：細(xì)胞間相互接觸；細(xì)胞與細(xì)胞外基 質(zhì)〔培養(yǎng)器皿壁或載體〕結(jié)合。多數(shù)細(xì)胞屬貼附型細(xì) 胞。 ：此類細(xì)胞體外生長(zhǎng)不必貼壁，可 在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)。如：白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，腫瘤 細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等。 第九頁，共一百一十二頁。 貼附型細(xì)胞 (anchoragedependent cell) 哺乳動(dòng)物大多數(shù)細(xì)胞必須附著固體外表生長(zhǎng)。當(dāng)細(xì)胞布滿表 面〔單層〕時(shí)，即停止生長(zhǎng)。假設(shè)取走一片細(xì)胞 ，存留的細(xì)胞就 會(huì)沿著外表生長(zhǎng)而重新布滿外表。從生長(zhǎng)外表脫落而進(jìn)入液體 的細(xì)胞通常不再生長(zhǎng)而逐漸退化。〔為單層附壁培養(yǎng)〕 按培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，可分四類： (fibroblast) 外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞相似，梭形或不規(guī)那么形。 細(xì)胞貼壁后呈梭形，胞質(zhì)外伸出 23個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，成 放射狀，胞間疏松。 起源于中胚層的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)一般表現(xiàn)為這種形式。 第十頁，共一百一十二頁。 貼附型細(xì)胞 2. 上皮型細(xì)胞 (epithelium)： 泛指形狀上類似上皮細(xì)胞的細(xì)胞。特點(diǎn)：扁平狀， 形態(tài)較為規(guī)那么。胞間緊密，單層貼壁。起源于內(nèi)、外 胚層的細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)如此。 3. 游走型細(xì)胞 (wandering)： 類似巨噬細(xì)胞樣的特征。外形不規(guī)那么。 分散生長(zhǎng)，不連接成片，成群落；通常伸出偽足和 突起，貼壁位置不固定，呈活潑的游走和變形運(yùn)動(dòng)。 單核巨噬細(xì)胞系細(xì)胞體外培養(yǎng)常如此：顆粒性白細(xì) 胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞。 第十一頁，共一百一十二頁。 貼附型細(xì)胞 4. 多形型細(xì)胞 ( polymorphic)： 形態(tài)上不規(guī)那么〔難以確定其形態(tài)〕的細(xì)胞。 細(xì)胞胞體略呈多角形；細(xì)胞胞突細(xì)長(zhǎng)形；類 似絲狀偽足。 如神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 第十二頁，共一百一十二頁。 影響細(xì)胞形態(tài)的主要因素 ? 細(xì)胞的來源不同； ? 生理?xiàng)l件不同，功能狀態(tài)不同； ? 血清成分、培養(yǎng)基成分、 添加成分、培養(yǎng)基的酸堿 ? 度、氣象環(huán)境、溫度等不同。 ? 如 HeLa細(xì)胞原本是一種上皮型癌細(xì)胞，但假設(shè)在過酸 ? 或過堿的條件下培養(yǎng)，可以呈現(xiàn)梭形，當(dāng)酸堿適中時(shí) ? 又可以恢復(fù)上皮型特征。 第十三頁，共一百一十二頁。 非貼附型細(xì)胞或懸浮型細(xì)胞〔 suspend cell〕 此類細(xì)胞體外生長(zhǎng)不必貼壁，可在培養(yǎng)液中 懸浮生長(zhǎng)。如：白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞 和雜交瘤細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞系等。 形態(tài)： 始終為球狀 優(yōu)點(diǎn)： 細(xì)胞密度高，培養(yǎng)效率高，易操作控 制，便于大規(guī)模生長(zhǎng)。 有些細(xì)胞既可懸浮，也可以貼附。 第十四頁，共一百一十二頁。 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性 貼附： 細(xì)胞接種后很快形成偽足，與底物點(diǎn)接觸，細(xì) 胞逐漸呈放射狀伸展，細(xì)胞體中心變扁平狀。 影響因素：低鈣不利于細(xì)胞伸展；低溫和培養(yǎng) 液流動(dòng)過快阻礙貼附；生物因素：表皮生長(zhǎng)因子 〔刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的皺褶活動(dòng)〕、成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子〔減少 3T3細(xì)胞的扁平度〕。 第十五頁，共一百一十二頁。 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性 接觸抑制〔 contact inhibition〕： 正常細(xì)胞移動(dòng)、靠近而接觸時(shí)，細(xì)胞不再移動(dòng)且 停止接觸區(qū)質(zhì)膜的皺褶活動(dòng)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞的 重疊生長(zhǎng)。腫瘤〔癌〕細(xì)胞無此現(xiàn)象。 密度抑制〔 density inhibition〕： 只要營(yíng)養(yǎng)充分，接觸抑制的細(xì)胞仍能分裂增殖。 但細(xì)胞密度進(jìn)一步加大、營(yíng)養(yǎng)減少、代謝產(chǎn)物增多 時(shí)，〔因營(yíng)養(yǎng)和代謝物的影響〕細(xì)胞分裂停止，出 現(xiàn)接觸抑制。 第十六頁，共一百一十二頁。 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖過程 、細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程： 培養(yǎng)的細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)的時(shí)間有限，最終自行停止生 長(zhǎng)。細(xì)胞的種類、性狀、原供體的年齡決定其生存時(shí) 間長(zhǎng)短。 如：人胚成纖維細(xì)胞存活一年、傳 30~50代相當(dāng)于 150~300個(gè)細(xì)胞周期〕；供體是成體或衰老個(gè)體時(shí)那么 存活更短；肝、腎細(xì)胞僅能傳幾代或十幾代。 獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化〔遺傳性改變〕生存期那么發(fā)生 變化。 第十七頁，共一百一十二頁。 細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程： 原代培養(yǎng)期〔 primary culture phage)：從取出 體內(nèi)組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的時(shí)期。 1~4周。 細(xì)胞：移動(dòng)活潑、分裂但不旺盛、相似于〔也能 代表〕體內(nèi)組織、藥物測(cè)試的好對(duì)象。 傳代期〔 passage phase〕：原代細(xì)胞生長(zhǎng)一 定時(shí)間后，將其分開接種到多個(gè)培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)的 過程稱傳代。 細(xì)胞系〔 cell line〕：傳代細(xì)胞分裂增殖旺盛、能 保持一致的二倍體核型，稱細(xì)胞系。細(xì)胞的代數(shù) =轉(zhuǎn) 接的次數(shù)。每一代中細(xì)胞分裂 3~6次。 第十八頁，共一百一十二頁。 細(xì)胞系的生長(zhǎng)過程： 衰亡期〔 senescence phase〕：細(xì)胞仍生存，但 不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。 細(xì)胞可發(fā)生自發(fā) 轉(zhuǎn)化，其標(biāo)志之一：獲永久增殖能力而成連續(xù)細(xì)胞系 〔株〕。連續(xù)細(xì)胞系〔株〕：主要發(fā)生在傳代期。 細(xì)胞系〔 cell line〕：第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞。 細(xì)胞株〔 cell strain〕：在經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系 中，通過單細(xì)胞培養(yǎng)或篩選法，由單細(xì)胞增殖形成的 細(xì)胞群。 亞株〔 substrain〕：？ 第十九頁，共一百一十二頁。 體 外 培 養(yǎng) 細(xì) 胞 系 的 生 長(zhǎng) 曲 線 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 t∕周 接種培養(yǎng) 第一次傳代 衰老 死亡 傳 代 期 細(xì) 胞 系 連續(xù)細(xì)胞系 原代 培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化 傳代間隔 細(xì) 胞 濃 度 的 指 數(shù) 第二十頁，共一百一十二頁。 每代〔群體〕細(xì)胞的生長(zhǎng)過程 每代細(xì)胞要經(jīng)過四個(gè)生長(zhǎng)階段： 潛伏期〔 latent phase〕： 接種 —— 懸浮 —— 貼附 —— 不馬上分裂〔潛伏〕。 原〔初〕代培養(yǎng)細(xì)胞： 24~96 h；傳代和腫瘤細(xì)胞： 6~24 h。 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期〔 logarthmic growth phase〕： 分裂旺盛、分裂相增多〔其數(shù)量標(biāo)志分裂的旺盛程 度〕。 細(xì)胞分裂指數(shù)〔 mitotic index, MI〕 : MI=(分裂相個(gè)數(shù) ∕1000個(gè)細(xì)胞 ) 100% 。初代 MI 低，傳代和腫瘤細(xì)胞系 MI高達(dá) 3~5% 。 第二十一頁，共一百一十二頁。 每代〔群體〕細(xì)胞的生長(zhǎng)過程 在理想的環(huán)境下，細(xì)胞處于較恒定的生長(zhǎng)分裂狀 況，其生長(zhǎng)速率： dN ∕dt ＝ μN(yùn) 〔 N—— 時(shí)間 t 時(shí)的細(xì)胞個(gè)數(shù)； μ—— 細(xì)胞比生長(zhǎng)速率：在對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期，群體細(xì)胞數(shù)增殖一倍所需要的時(shí)間，以時(shí)間 T 表示〕 積分得： T ＝ ㏑ 2 ∕μ (時(shí)間 T表示細(xì)胞比生長(zhǎng) 速率 ) 此時(shí)期細(xì)胞以指數(shù)形式增長(zhǎng)繁殖。持續(xù) 3~5天。 第二十二頁，共一百一十二頁。 每代〔群體〕細(xì)胞的生長(zhǎng)過程 穩(wěn)定期〔 stationary phase〕：因培養(yǎng)空間和營(yíng) 養(yǎng)物