【正文】 活因子〔 MAN〕、 T細(xì)胞替代因子 (TRF)等。 我國該領(lǐng)域的工作，取得了極有價值成果，我國曹 誼林教授在裸鼠背上復(fù)制人耳，引起國際巨大反響。 5〕 9~10個微擴(kuò)散裝置放入密閉小室內(nèi)，沖入 95%的 O2和 5%的 CO2的混合氣體， 37度培養(yǎng)。 3〕放入培養(yǎng)箱中 37℃ 培養(yǎng)。存活期可達(dá) 50天，發(fā)育與體內(nèi)相似。結(jié)果：股骨增長增粗，軟骨 細(xì)胞肥大。軟骨培養(yǎng)可采用旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法、 血漿凝塊培養(yǎng)法和金屬格柵培養(yǎng)法。 1938年，卡雷爾和林德伯格嘗試了采用無菌循環(huán)裝 置培養(yǎng)貓的甲狀腺，并維持?jǐn)?shù)星期。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 搖擺式器官培養(yǎng)法： 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法雖是動態(tài)培養(yǎng)，但操作復(fù)雜。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 瓊脂小島器官培養(yǎng)法： 瓊脂制成小島狀的支持物，放在液體培養(yǎng)基中， 將器官置于瓊脂上進(jìn)行培養(yǎng)。 最早的在氣 — 液外表進(jìn)行器官培養(yǎng)的方法。 器官型植塊置于液體培養(yǎng)基中，適當(dāng)搖動培養(yǎng)瓶， 以使液面的氧盡可能多地溶解在培養(yǎng)液中，并防止植 快下沉而黏附。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 表玻璃器官培養(yǎng)法： Ｆ ell 和 Robinson〔 1929〕建立。 胚胎器官培養(yǎng)的特點(diǎn)： 〔 1〕能量來源是糖酵解，培養(yǎng)時不需補(bǔ)充 O2。器官保存無 細(xì)胞增殖。 器官培養(yǎng) 概述： 器官培養(yǎng)：主要采用類似于組織培養(yǎng)中植塊培養(yǎng)的方式 培養(yǎng)器官型植塊?！?3〕多聚賴氨酸液。 第八十三頁，共一百一十二頁。緊貼骨骼肌細(xì)胞外表，扁平，有突起 能進(jìn)行有絲分裂。 第八十頁，共一百一十二頁。 3T3細(xì)胞培養(yǎng)液： DMEM加 10%胎牛血清、 4 mmol∕L谷 氨酰胺、青霉素 100 IU∕ml、鏈霉素 100 μg ∕ml。 上皮組織的體外培養(yǎng) 一、體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞生長的形態(tài)特征： 體內(nèi)上皮組織細(xì)胞：排列緊密、形態(tài)較一致、 有極少量的細(xì)胞間質(zhì)、被覆上皮分為單層和復(fù)層上皮 體外培養(yǎng)時： 〔 1〕局部保存體內(nèi)生長的特征：成群存在或緊密 相連成單層膜，極少離群獨(dú)存，表現(xiàn)群體依賴性 。 組織工程修復(fù)缺損器官 采用相容性好的生物可降解材料制成的各鐘三維結(jié) 構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)載體〔支架〕，在細(xì)胞增殖過程中，提 供營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氧和二氧化碳交換，排泄廢料，而 自身逐漸被人體降解、吸收、排泄，最后形成有特定 形態(tài)和功能的組織和器官。 。 、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。 第六十七頁，共一百一十二頁。 動物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 〔二〕細(xì)胞死亡與凋亡： 細(xì)胞系在生物反響器中死亡主要是細(xì)胞凋亡。 MG能改變氨基 酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基和巰基。 乳酸：糖代謝產(chǎn)物。 第六十頁，共一百一十二頁。 第五十八頁，共一百一十二頁。 第五十六頁，共一百一十二頁。 微多孔載體的制備方法 材料不同、制備方法不同。 微多孔載體培養(yǎng)：克服了其缺乏。 第四十九頁，共一百一十二頁。 微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞技術(shù) (Van Wezel,1967): 一定程度上改變了其缺乏、最初的載體為離子交換樹 脂微珠〔 60~250微米〕。包 括懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、微囊化培養(yǎng)、中空纖維 法、微多孔載體培養(yǎng)等。 與此相關(guān)的方法：載玻片加培養(yǎng)瓶法。 第四十頁，共一百一十二頁。 動物細(xì)胞培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法 ?懸滴培養(yǎng)法 ?旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 ?灌注小室培養(yǎng)法 ?培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 ?培養(yǎng)板培養(yǎng)法 第三十八頁，共一百一十二頁。 貼壁培養(yǎng)的生長特性 游離期： 接種的細(xì)胞，懸浮，細(xì)質(zhì)回縮變圓。 傳代培養(yǎng)： 原代細(xì)胞分裂增殖成片，布滿器皿外表時，那么需 對其別離進(jìn)行重新培養(yǎng)。如纖連蛋白〔 FN〕，層粘連蛋白〔 LN〕 等。現(xiàn)已有幾 十種，用途不同。用于原代和 細(xì)胞系的培養(yǎng)。 〔 1〕血清：主要為牛〔胎牛、新生牛、小?！?、 馬、雞、兔、羊、人血清。 培養(yǎng)條件和工具 一、培養(yǎng)條件： 溫度：多數(shù)哺乳動物 37℃ ，偏離那么影響代謝和 生長。 最高分裂次數(shù)限制：正常細(xì)胞都有，腫瘤〔癌〕細(xì) 胞沒有。初代 MI 低，傳代和腫瘤細(xì)胞系 MI高達(dá) 3~5% 。 細(xì)胞系〔 cell line〕：第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞。 傳代期〔 passage phase〕：原代細(xì)胞生長一 定時間后，將其分開接種到多個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)的 過程稱傳代。 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長與增殖過程 、細(xì)胞系的生長過程： 培養(yǎng)的細(xì)胞持續(xù)生長的時間有限，最終自行停止生 長。 體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長特性 貼附： 細(xì)胞接種后很快形成偽足，與底物點(diǎn)接觸，細(xì) 胞逐漸呈放射狀伸展，細(xì)胞體中心變扁平狀。 影響細(xì)胞形態(tài)的主要因素 ? 細(xì)胞的來源不同； ? 生理條件不同，功能狀態(tài)不同； ? 血清成分、培養(yǎng)基成分、 添加成分、培養(yǎng)基的酸堿 ? 度、氣象環(huán)境、溫度等不同。 3. 游走型細(xì)胞 (wandering)： 類似巨噬細(xì)胞樣的特征。〔為單層附壁培養(yǎng)〕 按培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，可分四類： (fibroblast) 外形與體內(nèi)成纖維細(xì)胞相似，梭形或不規(guī)那么形。多數(shù)細(xì)胞屬貼附型細(xì) 胞。 ，對機(jī)械攪拌或剪切力敏感。 動物細(xì)胞的特點(diǎn) 〔一〕動物細(xì)胞之間的連接特點(diǎn)： ：牢固、無間隙。 第三頁，共一百一十二頁。 第四章 動物細(xì)胞與組織培養(yǎng) (Animal Cell and Tissue Culture) 動物體內(nèi)取出組織和細(xì)胞，在體外模擬機(jī)體內(nèi)的生理 條件，建立無菌、適溫和一定的營養(yǎng)條件，使之生長 和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)，稱動物細(xì)胞與 組織培養(yǎng)。 4. 開展歷史 20世紀(jì) 40年代以后： 動物組織培養(yǎng)的科學(xué)家們研究重點(diǎn)集中在培養(yǎng) 基方面。 ： 23nm間隙。 。 ：此類細(xì)胞體外生長不必貼壁，可 在培養(yǎng)液中懸浮生長。 細(xì)胞貼壁后呈梭形，胞質(zhì)外伸出 23個長短不同的突起，成 放射狀，胞間疏松。外形不規(guī)那么。 ? 如 HeLa細(xì)胞原本是一種上皮型癌細(xì)胞，但假設(shè)在過酸 ? 或過堿的條件下培養(yǎng)，可以呈現(xiàn)梭形，當(dāng)酸堿適中時 ? 又可以恢復(fù)上皮型特征。 影響因素：低鈣不利于細(xì)胞伸展；低溫和培養(yǎng) 液流動過快阻礙貼附；生物因素：表皮生長因子 〔刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的皺褶活動〕、成纖維細(xì)胞生 長因子〔減少 3T3細(xì)胞的扁平度〕。細(xì)胞的種類、性狀、原供體的年齡決定其生存時 間長短。 細(xì)胞系〔 cell line〕：傳代細(xì)胞分裂增殖旺盛、能 保持一致的二倍體核型，稱細(xì)胞系。 細(xì)胞株〔 cell strain〕：在經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系 中，通過單細(xì)胞培養(yǎng)或篩選法，由單細(xì)胞增殖形成的 細(xì)胞群。 第二十一頁，共一百一十二頁。 第二十三頁，共一百一十二頁。高溫對細(xì)胞的威脅更大。各有特點(diǎn)。 第三十頁，共一百一十二頁。 第三十一頁，共一百一十二頁。 FN促進(jìn)中胚層源細(xì)胞的貼壁和分化； LN作用于 內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)胚層源細(xì)胞。 傳代技術(shù)的關(guān)鍵： 傳代時機(jī)： 8090%集合時最好〔過早：細(xì)胞 產(chǎn)量缺乏 過晚：細(xì)胞健康不佳〕。 吸附期： 細(xì)胞類型不同，貼壁時間有差異。 懸滴培養(yǎng)法 懸滴培養(yǎng)法：將組織器官植塊接種于一蓋玻片上， 加一滴培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)蓋玻片〔植塊和培養(yǎng)液懸掛〕放 置于凹形哉玻片上，熔蠟密封入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 灌注小室培養(yǎng)法 灌注小室培養(yǎng)法：最初由 Burrows〔 1912年〕設(shè) 計。優(yōu)點(diǎn)：防止 培養(yǎng)瓶外表粗糙對培養(yǎng)物的影響；方便染色觀察和永 久保存；增加了培養(yǎng)面積。 第四十四頁，共一百一十二頁。后經(jīng)改進(jìn)，選帶不同基團(tuán)的 葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子〔帶適當(dāng)電荷〕作微載體， 利于細(xì)胞的貼壁生長。 中空纖維法 中空纖維法： 1972年〔 Richard Kncazek〕創(chuàng)造。載體內(nèi)部有網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)的小孔供細(xì)胞生長、增加細(xì)胞的固定化和穩(wěn)定 化，可用于大規(guī)模高密度培養(yǎng)動物細(xì)胞。 1. 高溫?zé)Y(jié)法：玻璃、陶瓷等。 微多孔載體的制備方法 5. 油浴復(fù)相乳液別離法：油溶性成孔材料 K劇烈攪拌 乳化分散到成球材料 P 的水溶液中 → 水包油型小液滴 → 在分散到油性物質(zhì) O中 → 復(fù)相油滴 → 溶劑 N〔與水混 溶但不溶解 P〕吸出液滴中的水分 → 硬化成固體小球 → 加熱、減壓、溶劑萃取、冰凍枯燥等去除成孔材料 → 多孔微球。 動物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 二、應(yīng)用： 1962年以后，動物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模開始擴(kuò)大，如今 已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用領(lǐng)域廣泛采用的技術(shù)方 法。 動物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用 酶類：組織血纖維溶酶原激活計〔 tPA〕等； 激素：紅細(xì)胞生產(chǎn)素〔 EPO〕、促黃體生成素 〔 LH〕、促濾泡素〔 FSH〕 。高濃度乳酸 → 抑制乳酸脫氫酶 〔 LDH〕活性 → 減少乳酸產(chǎn)生 → 阻止 NAD的再生和丙酮酸 ∕乳 酸轉(zhuǎn)換 →NADH 增加 → 抑制糖酵解、低濃度丙酮酸、 Gln消耗 減少 → 產(chǎn)能減少 → 抑制生長。葡萄糖濃度很高時， MG升 高。 bel2基因的過量表達(dá)：能抑制 Gln或缺氧引起的細(xì) 胞調(diào)亡、減少細(xì)胞特定成分的消耗、提高細(xì)胞密度和 目的蛋白的產(chǎn)量。 動物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 〔四〕過程監(jiān)控： 因大量細(xì)胞的代謝，培養(yǎng)環(huán)境會迅速改變，過程的 再線監(jiān)控是非常重要的。 。 第七十頁，共一百一十二頁。 其優(yōu)勢明顯、應(yīng)用前景誘人：運(yùn)用生物工程技術(shù)， 利用人體剩余器官的少量正常細(xì)胞進(jìn)行體外繁殖，既 可獲得患者急需的具有相同功能的器官，又無排斥反 應(yīng)，現(xiàn)已取得滿意的成果。 〔 2〕接觸抑制：培養(yǎng)一段時間后，細(xì)胞增多成片 后，運(yùn)動和生長受到抑制。 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液 ： DMEM和 F12 (3﹕ 1)加 10%胎牛血 清、 4 mmol∕L谷氨酰胺、青 100IU∕ml、鏈霉素 100 μg ∕ ml、 5 μg ∕ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、 5μg ∕ml胰島素等。 肌肉組織的體外培養(yǎng) 肌肉組織的特點(diǎn)： 又稱肌組織，來自于中胚層具收縮能力的肌細(xì)胞。肌肉受傷后，肌衛(wèi)細(xì)胞分裂，轉(zhuǎn)化 為肌細(xì)胞，進(jìn)一步分化為肌纖維，填補(bǔ)受傷部位。 骨骼肌培養(yǎng)的結(jié)果： 接種數(shù)小時后多數(shù)細(xì)胞貼壁，主要為單核〔外觀明顯〕細(xì) 胞；前 2