【正文】 4孔、 96孔 〔 96孔最常用〕。 第四十一頁，共一百一十二頁。 優(yōu)點： 培養(yǎng)物交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境利于細 胞組織生長。隨著細胞數(shù)量的增多，開始接觸并連接成片，這 時期細胞分裂及運動停止。 〔 2〕塑料：聚苯乙烯。 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù) 原代培養(yǎng) 組織塊培養(yǎng) 處死動物，無菌取組織塊入小燒杯中，用尖嘴眼 科剪刀將組織塊剪碎，吸管吸取 Hanks液沖下剪刀上 的碎片，補加 35mLHanks液，用吸管輕輕吹打，低 速離心，棄去上清液，留下組織塊。 包括兩局部： 根底培養(yǎng)液：合成培養(yǎng)液，如 HamF12和 DMEM 以及許多已商品化的根底培養(yǎng)液， SEM用于角質(zhì)細 胞 ,SFM 用于淋巴細胞，等等。 〔 1〕根本培養(yǎng)基〔 essential medium〕：人工合成 的只能使體外培養(yǎng)細胞短暫生存〔添加天然培養(yǎng)基后 細胞才能繁殖〕的培養(yǎng)基。 培養(yǎng)條件 —— 天然培養(yǎng)基 血清提供細胞生存、生長和增殖必須的激素與生長 因子：胰島素、腎上腺皮質(zhì)激素、類固醇激素〔雌二 醇、孕酮、睪酮〕、成纖維細胞生長因子〔 FGF〕、 表皮生長因子〔 EGF〕、血小板生長因子〔 PDGF〕 〔 2〕 鼠尾膠原及其他膠原：細胞附著、生長的 基質(zhì)，利于組織〔特別是上皮類〕細胞的固定。 第二十八頁，共一百一十二頁。 易污染、防污染：細菌、真菌、病毒；血清和 組織材料。 每代〔群體〕細胞的生長過程 穩(wěn)定期〔 stationary phase〕：因培養(yǎng)空間和營 養(yǎng)物質(zhì)有限，特別是代謝廢物的累積，細胞進入：新 分裂的細胞數(shù)與死亡的細胞數(shù)相等的動態(tài)平衡時期。 原〔初〕代培養(yǎng)細胞： 24~96 h；傳代和腫瘤細胞： 6~24 h。 細胞系的生長過程： 衰亡期〔 senescence phase〕：細胞仍生存，但 不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。 細胞系的生長過程： 原代培養(yǎng)期〔 primary culture phage)：從取出 體內(nèi)組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的時期。 密度抑制〔 density inhibition〕： 只要營養(yǎng)充分，接觸抑制的細胞仍能分裂增殖。 形態(tài)： 始終為球狀 優(yōu)點： 細胞密度高，培養(yǎng)效率高，易操作控 制，便于大規(guī)模生長。 貼附型細胞 4. 多形型細胞 ( polymorphic)： 形態(tài)上不規(guī)那么〔難以確定其形態(tài)〕的細胞。特點：扁平狀， 形態(tài)較為規(guī)那么。當細胞布滿表 面〔單層〕時，即停止生長。 ?是動物細胞工程的重要技術(shù)根底。 第六頁，共一百一十二頁。雜交瘤細胞能在體外懸浮情況下大 ? 量繁殖并產(chǎn)生單克隆抗體。 4. 開展歷史 動物細胞〔組織〕培養(yǎng)技術(shù)的起源： 19世紀所應(yīng)用的胚胎學技術(shù)。 概 述 ? 4. 開展歷史 ? 動物細胞的特點 ? 動物細胞與組織培養(yǎng)的概念 ? 動物細胞的體外培養(yǎng)生長特性 第二頁，共一百一十二頁。 4. 開展歷史 ? 近年： ? 淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，使動物細胞培養(yǎng)進入了 ? 一個新領(lǐng)域。 ： 有間隙，有纖維形成的特殊結(jié)構(gòu)。 動物細胞與組織培養(yǎng)的概念 ?動物細胞與組織培養(yǎng)：從動物體內(nèi)取出 ?細胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境條件， ?在無菌、適宜溫度和豐富營養(yǎng)條件下，使 ?離體細胞或組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和 ?功能的一門技術(shù)。 貼附型細胞 (anchoragedependent cell) 哺乳動物大多數(shù)細胞必須附著固體外表生長。 貼附型細胞 2. 上皮型細胞 (epithelium)： 泛指形狀上類似上皮細胞的細胞。 第十一頁，共一百一十二頁。如：白細胞、淋巴細胞，腫瘤細胞 和雜交瘤細胞以及轉(zhuǎn)化細胞系等。腫瘤〔癌〕細胞無此現(xiàn)象。 第十七頁，共一百一十二頁。 第十八頁，共一百一十二頁。 每代〔群體〕細胞的生長過程 每代細胞要經(jīng)過四個生長階段： 潛伏期〔 latent phase〕： 接種 —— 懸浮 —— 貼附 —— 不馬上分裂〔潛伏〕。 第二十二頁，共一百一十二頁。 體外培養(yǎng)的特點 動物細胞營養(yǎng)需求苛刻：氨基酸〔細胞是不能自 主合成必須氨基酸的〕、單糖〔能源；合成某些氨基 酸、脂肪、核酸的原料〕、維生素〔輔酶、輔基〕、 其他大量和微量元素、促生長因子和激素〔促進細胞 生長、維持細胞功能、保持細胞分化和未分化狀態(tài)〕 培養(yǎng)環(huán)境條件要求嚴格：溫度、滲透壓〔多數(shù) 哺乳動物細胞 260~320mOsm∕kg〕、 pH〔及溶氧量 CO2和 HO〕的相對恒定、剪切力等。 O2 ？ CO2 ？ CO2培養(yǎng)箱？ 營養(yǎng)：需要氨基酸、維生素、輔酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生長因子。 第二十九頁，共一百一十二頁。 使用時需加天然培養(yǎng)基。在根底理論研究中 血清的使用影響實驗結(jié)果〔原因與結(jié)果難以對應(yīng)〕。 第三十三頁，共一百一十二頁。 〔 1〕玻璃：明礬 —— 硅硼膠玻璃。經(jīng)一段停滯，開始分 裂。 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法： 1933~1934年 Gey 和 Lewis建立管 狀培養(yǎng)器皿固定于旋轉(zhuǎn)裝置上旋轉(zhuǎn)， 培養(yǎng)物接種于器 皿 中培養(yǎng)。 后來的許多大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)在設(shè)計上都參考了此 方法的原理。曾叫微量培養(yǎng)法，是最常用 的體外培養(yǎng)技術(shù)方法。 第四十五頁，共一百一十二頁。 微囊化培養(yǎng)技術(shù) 將細胞包裹在微囊中進行懸浮培養(yǎng)。別離純化細胞分泌物極其方便。 微多孔載體培養(yǎng)技術(shù) 微多孔載體的制作材料：生物相容性〔無毒、黏 附細胞〕、機械穩(wěn)定性〔保證長期攪拌不破粹和清洗 處理回收利用〕、熱穩(wěn)定性〔高溫高壓滅菌不分解、 不破粹、不軟化〕要好。 微多孔載體的制備方法 2. 高分子材料成球聚和法： 水〔懸浮分散介質(zhì)〕加分散劑，強力攪拌 → 不溶 于水的單體分散成小液珠 → 加引發(fā)劑〔油溶性〕 → 成 珠狀小球 →100~105 ℃ 去除未反響的單體和成孔物質(zhì) → 稀酸清洗夾在微球中的分散劑 → 多孔微球 → 氧化劑 處理使其外表極化 → 親水的多孔載體。因為動物細胞沒有細胞壁、非常脆弱、對剪切 敏感、對培養(yǎng)環(huán)境要求嚴格。 動物細胞能精確地轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工較大或更復(fù)雜的 蛋白質(zhì)〔特別是加工蛋白質(zhì)的環(huán)境、過程、結(jié)果等是 植物微生物細胞極少有的〕；能將目的蛋白分泌到培 養(yǎng)液中，從而簡化了蛋白質(zhì)的別離、純化。 動物細胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 三、關(guān)鍵技術(shù) 〔一〕細胞培養(yǎng)環(huán)境 〔二〕細胞死亡與凋亡 〔三〕培養(yǎng)基與細胞系 〔四〕過程監(jiān)控 第六十二頁，共一百一十二頁。 關(guān)鍵技術(shù) —— 細胞培養(yǎng)環(huán)境： 二氧化碳： CO2 累積改變 細胞代謝水平、對細胞產(chǎn)生 毒性。 關(guān)鍵技術(shù) —— 細胞培養(yǎng)環(huán)境： 滲透壓：高滲透壓提高細胞生產(chǎn)抗體的濃度、影響對數(shù) 生長期長短、細胞死亡速度。 第六十六頁，共一百一十二頁。 重要〔有效〕參數(shù)：溫度、 pH、溶解氧濃度。 動物細胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 今后應(yīng)重點開展的工作： 論研究。 修復(fù)缺損器官的方法 修復(fù)缺損器官： 自體移植：“拆東墻補西墻〞 —— 增加患者痛苦、有的器官 獨一無二而無法移植。 正在實驗室里生長成形的：肝臟、胰臟、心臟 乳房、手指、耳朵等。 角質(zhì)形成細胞體外培養(yǎng)較經(jīng)典的方法 —— 飼養(yǎng)層 細胞培養(yǎng)法〔 Rheinwald 和 Green, 1975〕： 原理及優(yōu)點：將別離的角質(zhì)形成細胞種植在經(jīng) 過處理的小鼠 3T3滋養(yǎng)細胞形成的飼養(yǎng)層上，以促進 角質(zhì)形成細胞的生長與分化；細胞接種密度抵、增殖 快、生長穩(wěn)定、傳代較好。 〔 2〕飼養(yǎng)層細胞的制備： 3T3細胞覆蓋瓶底一半時 → 換培養(yǎng) 液 → 培養(yǎng) 24h → 接近融合 → 加 1~10 μg ∕ml絲裂霉素 C，培養(yǎng) 12h → 培養(yǎng)液洗滌細胞 3次 → 胰蛋白酶消化 → 種植在培養(yǎng)瓶中 → 加角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)液 →37 ℃ 培養(yǎng) → 貼壁后 12h〔再種植角 質(zhì)形成細胞〕。肌肉細胞富含肌原纖維具收縮能力，故培 養(yǎng)方法上有其特殊性。 骨骼肌的培養(yǎng)： 材料：組織來源 —— 胚胎或新生〔 1~2天最好〕大鼠大腿 肌肉；培養(yǎng)液 —— Eagle MEM或 DMEM〔添加 FCS或 ∕和馬血 清、雞胚液〕。 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) 神經(jīng)細胞〔神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞〕組成神經(jīng) 組織。 神經(jīng)組織 的體外培養(yǎng) 結(jié)果： 用神經(jīng)元特異性標志物進行免疫細胞化學鑒定證 實，大約 98%的細胞是神經(jīng)元性質(zhì)的細胞。 .1 器官培養(yǎng) 概述 迄今，文獻報道已在培養(yǎng)的人體器官：乳腺、眼、 內(nèi)耳、肝、腦、角膜、腎、肺、骨、皮膚、子宮、胸 腺、腸、牙、氣管、副甲狀腺、心臟、食管等等。 〔 3〕器官培養(yǎng)無器官數(shù)量的增加。 胚胎與成體器官培養(yǎng)的特點 成體器官培養(yǎng)的特點： 〔 1〕能量來自有氧代謝，因此需充足的 O2供給， 器官植塊中心才不會缺氧而壞死。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 瓊脂凝膠培養(yǎng)法： 培養(yǎng)液加瓊脂形成凝膠，故培養(yǎng)基質(zhì)不液化，器官 組織的細胞在其上的遷移受到抑制。 此法適合于高耗氧的成體器官的培養(yǎng)。 金屬格柵替代漂浮支持物〔 Trowell,1954〕。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法： 最早于 1933年〔 Gey〕建立。空氣通 過過濾器進入儲液罐對培養(yǎng)液進行充氧和穩(wěn)定 pH。 第一百零三頁，共一百一十二頁。 2. 用小鑷子在骶關(guān)節(jié)處解離雞胚下肢。 具體操作步驟： 1. 乙醚麻醉懷孕大鼠，消毒、固定開腹取子宮于培 養(yǎng)皿中，開子宮取出鼠胎。懸浮孵育法 培養(yǎng)具體操作如下： 培養(yǎng)基：血漿、 199和 DEM培養(yǎng)基。 1〕拉頸處死 13日齡大鼠，消毒，取出肝臟，置于含培養(yǎng)液 的培養(yǎng)皿中。 最新進展 名副其實的備用人體器官將在數(shù)年內(nèi)由實驗室走向 患者。 內(nèi)容總結(jié) 第四章 動物細胞與組織培養(yǎng) (Animal Cell and Tissue Culture)。