【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞技術(shù) (Van Wezel,1967): 一定程度上改變了其缺乏、最初的載體為離子交換樹(shù) 脂微珠〔 60~250微米〕。后經(jīng)改進(jìn)，選帶不同基團(tuán)的 葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子〔帶適當(dāng)電荷〕作微載體， 利于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)。 第四十七頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 微載體培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞支持物〔微載體基質(zhì)〕 應(yīng)具備的特征： 1. 生物相容性； 2. 簡(jiǎn)便的無(wú)毒害固定化 3. 良好的傳質(zhì)特性； ； 5. 最大的比外表積、 ； 7. 粒徑分布均一； 8. 能高壓滅菌； 9. 可重復(fù)利用，易于清洗； 10. 保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷； ； ； ； ； ； 第四十八頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 微囊化培養(yǎng)技術(shù) 將細(xì)胞包裹在微囊中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。微囊是一種人 造半透膜制成的微球體，小分子 物質(zhì)可自由穿過(guò)， 酶、輔酶、離子交換劑、活性碳、蛋白質(zhì)包裹在其中 不能逸出，催化反響底物。 20世紀(jì) 80年代初〔 Lim和 Sum〕制成了細(xì)胞能在其 中生長(zhǎng)的微囊。微囊材料：海藻酸〔 1,4鍵連接的多 聚甘露糖醛酸和古羅糖醛酸〕、多聚賴氨酸。 第四十九頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 中空纖維法 中空纖維法： 1972年〔 Richard Kncazek〕創(chuàng)造。 最初由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的半透膜， 外表有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞生存的立 體三維空間〔類似于毛細(xì)血管〕。 3~6層空心纖維構(gòu)成培養(yǎng)系統(tǒng)，細(xì)胞接種于空心纖 維的外腔。別離純化細(xì)胞分泌物極其方便。 現(xiàn)在已開(kāi)發(fā)出硅膠、聚砜、聚丙烯等的空心纖維。 第五十頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 微多孔載體培養(yǎng)技術(shù) 傳統(tǒng)實(shí)心微載體的缺乏：只能固定貼壁細(xì)胞、后期 細(xì)胞老化而脫落、貼壁需血清中的因子幫助。 微多孔載體培養(yǎng)：克服了其缺乏。載體內(nèi)部有網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)的小孔供細(xì)胞生長(zhǎng)、增加細(xì)胞的固定化和穩(wěn)定 化，可用于大規(guī)模高密度培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：降低血清用量、易固定化、比外表積大、細(xì) 胞免受機(jī)械損傷、適合于懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流 培養(yǎng)、也適合于大規(guī)模高密度培養(yǎng)系統(tǒng)。 第五十一頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 微多孔載體培養(yǎng)技術(shù) 微多孔載體的制作材料：生物相容性〔無(wú)毒、黏 附細(xì)胞〕、機(jī)械穩(wěn)定性〔保證長(zhǎng)期攪拌不破粹和清洗 處理回收利用〕、熱穩(wěn)定性〔高溫高壓滅菌不分解、 不破粹、不軟化〕要好。 制備： 1. 成球材料和臨時(shí)性成孔材料分散于介質(zhì) 中液滴， 2. 液滴固化成小球， 3. 去除〔如高溫?zé)Y(jié)〕 臨時(shí)性成孔材料，形成多孔微球， —— 表 面處理、清洗、滅菌等。 第五十二頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 多孔微載體的制備 成球材料 分散 介質(zhì) 成 球 成孔 去除球中的成孔物質(zhì) 后期處理 多孔微載體 第五十三頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 微多孔載體的制備方法 材料不同、制備方法不同。 1. 高溫?zé)Y(jié)法：玻璃、陶瓷等。 高嶺土、云母〔成孔材料〕、礬土、氫氧化鋁、 二氧化硅 → 碾細(xì)混勻，加甲基醋酸纖維素 → 漿液 → 擠壓 → 球狀顆粒 → 枯燥 →1000 ℃ 燒結(jié)幾小時(shí) → 陶 瓷小顆粒 →1400 ℃ → 熔化云母 → 多孔陶瓷載體。 第五十四頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 微多孔載體的制備方法 2. 高分子材料成球聚和法： 水〔懸浮分散介質(zhì)〕加分散劑，強(qiáng)力攪拌 → 不溶 于水的單體分散成小液珠 → 加引發(fā)劑〔油溶性〕 → 成 珠狀小球 →100~105 ℃ 去除未反響的單體和成孔物質(zhì) → 稀酸清洗夾在微球中的分散劑 → 多孔微球 → 氧化劑 處理使其外表極化 → 親水的多孔載體。 第五十五頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 微多孔載體的制備方法 ： 海藻酸鈉溶液在氯化鈣溶液 中快速凝聚成球。 ： 成球材料溶于水溶液 → 銳 孔噴射成小液滴 → 低溫疏水性物質(zhì)中 → 遇冷凝固 → 含冰晶的固體小球 → 物理化學(xué)方法固化成球材料 → 去除小球中的冰晶，成多孔性小球。 第五十六頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 微多孔載體的制備方法 5. 油浴復(fù)相乳液別離法：油溶性成孔材料 K劇烈攪拌 乳化分散到成球材料 P 的水溶液中 → 水包油型小液滴 → 在分散到油性物質(zhì) O中 → 復(fù)相油滴 → 溶劑 N〔與水混 溶但不溶解 P〕吸出液滴中的水分 → 硬化成固體小球 → 加熱、減壓、溶劑萃取、冰凍枯燥等去除成孔材料 → 多孔微球。 第五十七頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 一、生物反響器： 傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵反響器不適用于動(dòng)物細(xì)胞的大量 培養(yǎng)。因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁、非常脆弱、對(duì)剪切 敏感、對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格。 20世紀(jì) 70年代以來(lái)，細(xì)胞培養(yǎng)用反響器種類越來(lái) 越多，規(guī)模越來(lái)越大。但其結(jié)構(gòu)形式仍以攪拌式、氣 升式、固定床為主。 國(guó)外，氣升式反響器已放大到 5 000~10 000L，攪 拌式反響器到達(dá) 8 000L。 第五十八頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 二、應(yīng)用： 1962年以后，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模開(kāi)始擴(kuò)大，如今 已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用領(lǐng)域廣泛采用的技術(shù)方 法。 利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)具有獨(dú)特的 作用和意義，也是植物、微生物細(xì)胞培養(yǎng)所無(wú)法替代 的。動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境與植物微生物細(xì)胞全然不同。 動(dòng)物細(xì)胞能精確地轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工較大或更復(fù)雜的 蛋白質(zhì)〔特別是加工蛋白質(zhì)的環(huán)境、過(guò)程、結(jié)果等是 植物微生物細(xì)胞極少有的〕；能將目的蛋白分泌到培 養(yǎng)液中，從而簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)的別離、純化。 第五十九頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 二、應(yīng)用：目前動(dòng)物細(xì)胞生物反響器培養(yǎng)生產(chǎn)的生物 制品主要類型： 病毒疫苗：如乙肝疫苗〔 HbsAg〕、脊髓灰質(zhì)炎 疫苗〔 Polio〕、狂犬疫苗〔 Rabies〕等； 非抗體免疫調(diào)節(jié)劑：如干擾素〔 IFN〕、白細(xì)胞 介素〔 IL〕、 B細(xì)胞生長(zhǎng)因子〔 BCGF〕、巨噬細(xì)胞激 活因子〔 MAN〕、 T細(xì)胞替代因子 (TRF)等。 多肽生長(zhǎng)因子：神經(jīng)生長(zhǎng)因子〔 NGF〕、成纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)因子〔 FGF〕、表皮生長(zhǎng)因子〔 EGF〕、血 清生長(zhǎng)因子〔 SF〕等。 第六十頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用 酶類：組織血纖維溶酶原激活計(jì)〔 tPA〕等； 激素：紅細(xì)胞生產(chǎn)素〔 EPO〕、促黃體生成素 〔 LH〕、促濾泡素〔 FSH〕 。 腫瘤特異性抗原：癌胚抗原〔 CEA〕等； 單克隆抗體〔 MCAB〕； 病毒殺蟲(chóng)劑：桿狀病毒等。 第六十一頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 三、關(guān)鍵技術(shù) 〔一〕細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境 〔二〕細(xì)胞死亡與凋亡 〔三〕培養(yǎng)基與細(xì)胞系 〔四〕過(guò)程監(jiān)控 第六十二頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 三、關(guān)鍵技術(shù)： 〔一〕細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境： 氨離子：提高細(xì)胞密度的主要限制因子是培養(yǎng)環(huán)境中抑 制因素的積累。氨的積聚〔來(lái)源于培養(yǎng)基和細(xì)胞的代謝〕使細(xì) 胞內(nèi) UDP氨基己糖增加，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)糖基化過(guò) 程。應(yīng)防止培養(yǎng)基中 Gln自然分解和盡量去除培養(yǎng)基中的氨。 乳酸：糖代謝產(chǎn)物。高濃度乳酸 → 抑制乳酸脫氫酶 〔 LDH〕活性 → 減少乳酸產(chǎn)生 → 阻止 NAD的再生和丙酮酸 ∕乳 酸轉(zhuǎn)換 →NADH 增加 → 抑制糖酵解、低濃度丙酮酸、 Gln消耗 減少 → 產(chǎn)能減少 → 抑制生長(zhǎng)。因此應(yīng)減少培養(yǎng)基中葡萄糖的濃 度〔以減少乳酸〕同時(shí)平衡葡萄糖與 Gln的比例。 第六十三頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 關(guān)鍵技術(shù) —— 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境： 二氧化碳： CO2 累積改變 細(xì)胞代謝水平、對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生 毒性。應(yīng)通過(guò)控制供氣參數(shù)，平衡氧的輸送及 CO2的去除，防 止生物反響器運(yùn)轉(zhuǎn)中 CO2的積累。 甲基乙二醛〔 MG)：為丙糖磷酸去磷酸基〔主要〕、 脂類、氨基酸代謝產(chǎn)物。對(duì)細(xì)胞有潛在損傷。 MG能改變氨基 酸、蛋白質(zhì)和核酸的氨基和巰基。葡萄糖濃度很高時(shí)， MG升 高。加小牛血清可降低 MG的濃度。 第六十四頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 關(guān)鍵技術(shù) —— 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境： 滲透壓：高滲透壓提高細(xì)胞生產(chǎn)抗體的濃度、影響對(duì)數(shù) 生長(zhǎng)期長(zhǎng)短、細(xì)胞死亡速度。滲透壓保護(hù)劑：甘氨酸、甜菜堿 和三甲基甘氨酸或脯氨酸可一定程度保護(hù)高滲對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑 制作用，并不影響目的蛋白的表達(dá)水平，還可使細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間維 持高表達(dá)水平。 載體：用多孔微載體替代常規(guī)載體〔細(xì)胞易受機(jī)械攪拌和噴氣損傷〕。 第六十五頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 〔二〕細(xì)胞死亡與凋亡： 細(xì)胞系在生物反響器中死亡主要是細(xì)胞凋亡。 bel2基因的過(guò)量表達(dá)：能抑制 Gln或缺氧引起的細(xì) 胞調(diào)亡、減少細(xì)胞特定成分的消耗、提高細(xì)胞密度和 目的蛋白的產(chǎn)量?？赏ㄟ^(guò)基因工程方法將 bel2這種抑 制細(xì)胞調(diào)亡的基因?qū)爰?xì)胞。 在大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件下，細(xì)胞死亡或凋亡 主要是：營(yíng)養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多。 第六十六頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 〔三〕培養(yǎng)基與細(xì)胞系： 培養(yǎng)基：歷經(jīng)天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基到現(xiàn)今的無(wú) 血清培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基：防止了血清的批次、質(zhì) 量、成分等對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的污染、毒性作用、不利于產(chǎn) 品純化等不良影響。 細(xì)胞系或細(xì)胞珠不同，其無(wú)血清培養(yǎng)基需求不同， 在細(xì)胞早期培養(yǎng)階段，細(xì)胞對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的適應(yīng)性 往往是特異性的。 第六十七頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 動(dòng)物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 〔四〕過(guò)程監(jiān)控： 因大量細(xì)胞的代謝，培養(yǎng)環(huán)境會(huì)迅速改變，過(guò)程的 再線監(jiān)控是非常重要的。 離線測(cè)定：需要時(shí)間長(zhǎng)，來(lái)不及指導(dǎo)控制有關(guān)參數(shù) 和培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化、頻繁取樣易污染和增加費(fèi)用。 在線測(cè)定：培養(yǎng)條件、代謝產(chǎn)物、目的產(chǎn)物等是大 規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的需要。 重要〔有效〕參數(shù)：溫度、 pH、溶解氧濃度。 第六十八頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程目前存在的問(wèn)題： ，產(chǎn)物濃度低。 、長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中分泌產(chǎn)物能 力易喪失，或產(chǎn)物活性易降低。 、培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體很昂貴。 。 ，限制了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)。 第六十九頁(yè)，共一百一十二頁(yè)。