【正文】 了優(yōu)良培養(yǎng)系統(tǒng)的開發(fā)。 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀與展望 今后應(yīng)重點(diǎn)開展的工作： 論研究。 、細(xì)胞解離容易，并能重復(fù)使 用的新型廉價(jià)的微載體。 。 組織工程 概述 組織工程： 組織工程：應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，將人體的某局部組織細(xì)胞種植和吸附在一種生物材料的支架上進(jìn)行人工培養(yǎng)、繁殖、擴(kuò)增，然后移植到人體內(nèi)所需要的部位，從而到達(dá)器官修復(fù)或再造的治療目的的一種技術(shù)。 修復(fù)缺損器官的方法 修復(fù)缺損器官： 自體移植：“拆東墻補(bǔ)西墻〞 —— 增加患者痛苦、有的器官 獨(dú)一無二而無法移植。動(dòng)物器官移植同樣 存在免疫排斥反響，且有將動(dòng)物的一些病毒傳染給人類的危險(xiǎn) 組織代用品：如硅膠、不銹鋼、金屬合金等，致命弱點(diǎn) 是與人體組織相容性差，不能長久使用，還易引起感染。 組織工程修復(fù)缺損器官 采用相容性好的生物可降解材料制成的各鐘三維結(jié) 構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)載體〔支架〕，在細(xì)胞增殖過程中，提 供營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氧和二氧化碳交換，排泄廢料，而 自身逐漸被人體降解、吸收、排泄，最后形成有特定 形態(tài)和功能的組織和器官。 第七十三頁，共一百一十二頁。 正在實(shí)驗(yàn)室里生長成形的：肝臟、胰臟、心臟 乳房、手指、耳朵等。 第七十四頁，共一百一十二頁。 上皮組織的體外培養(yǎng) 一、體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞生長的形態(tài)特征： 體內(nèi)上皮組織細(xì)胞：排列緊密、形態(tài)較一致、 有極少量的細(xì)胞間質(zhì)、被覆上皮分為單層和復(fù)層上皮 體外培養(yǎng)時(shí)： 〔 1〕局部保存體內(nèi)生長的特征：成群存在或緊密 相連成單層膜，極少離群獨(dú)存，表現(xiàn)群體依賴性 。 第七十六頁，共一百一十二頁。 角質(zhì)形成細(xì)胞體外培養(yǎng)較經(jīng)典的方法 —— 飼養(yǎng)層 細(xì)胞培養(yǎng)法〔 Rheinwald 和 Green, 1975〕： 原理及優(yōu)點(diǎn)：將別離的角質(zhì)形成細(xì)胞種植在經(jīng) 過處理的小鼠 3T3滋養(yǎng)細(xì)胞形成的飼養(yǎng)層上，以促進(jìn) 角質(zhì)形成細(xì)胞的生長與分化；細(xì)胞接種密度抵、增殖 快、生長穩(wěn)定、傳代較好。 上皮組織的體外培養(yǎng) 二、表皮組織的體外培養(yǎng)： 實(shí)驗(yàn)材料： 表皮細(xì)胞來源： 外科手術(shù)取包皮、乳腺、腹部皮膚，流產(chǎn) 胎兒皮膚最好，燒傷的依情況定。 3T3細(xì)胞培養(yǎng)液： DMEM加 10%胎牛血清、 4 mmol∕L谷 氨酰胺、青霉素 100 IU∕ml、鏈霉素 100 μg ∕ml。 第七十八頁，共一百一十二頁。 〔 2〕飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備： 3T3細(xì)胞覆蓋瓶底一半時(shí) → 換培養(yǎng) 液 → 培養(yǎng) 24h → 接近融合 → 加 1~10 μg ∕ml絲裂霉素 C，培養(yǎng) 12h → 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 3次 → 胰蛋白酶消化 → 種植在培養(yǎng)瓶中 → 加角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液 →37 ℃ 培養(yǎng) → 貼壁后 12h〔再種植角 質(zhì)形成細(xì)胞〕。 第七十九頁，共一百一十二頁。 第八十頁，共一百一十二頁。肌細(xì)胞 間有少量的結(jié)締組織、豐富的血管和神經(jīng)。肌肉細(xì)胞富含肌原纖維具收縮能力，故培 養(yǎng)方法上有其特殊性。 第八十一頁，共一百一十二頁。緊貼骨骼肌細(xì)胞外表，扁平，有突起 能進(jìn)行有絲分裂。 成熟的骨骼肌細(xì)胞不能進(jìn)行有絲分裂。 骨骼肌的培養(yǎng)： 材料：組織來源 —— 胚胎或新生〔 1~2天最好〕大鼠大腿 肌肉；培養(yǎng)液 —— Eagle MEM或 DMEM〔添加 FCS或 ∕和馬血 清、雞胚液〕?！?2〕接種在 10% CO飽和濕度 環(huán)境中培養(yǎng)。 第八十三頁，共一百一十二頁。 肌肉細(xì)胞系的建立：肌細(xì)胞的連續(xù)選擇性傳代，低密度接 種到有〔或無〕飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)板上，形成單細(xì)胞克隆，可 以防止肌源性表型的過早喪失。 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) 神經(jīng)細(xì)胞〔神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞〕組成神經(jīng) 組織。 培養(yǎng)對(duì)象、條件、設(shè)備等不同，培養(yǎng)方法不同?！?3〕多聚賴氨酸液。 神經(jīng)組織的體外培養(yǎng) 培養(yǎng)步驟： 〔 1〕取大鼠胸、腰段脊髓，剔除脊膜，顯微鏡下別離暗灰色 組織，剪碎； 〔 2〕 37℃ %胰蛋白酶消化 15 min，胎牛血清終止酶活性 后，離心、懸浮、吹打，再離心，制得細(xì)胞懸浮液； 〔 3〕 10ml 細(xì)胞懸液于直徑 100mm培養(yǎng)皿中， 37℃ 、 5%的 CO2 孵育 2~3h，利于最大限度貼壁； 〔 4〕未貼壁的細(xì)胞離心，重新獲得細(xì)胞懸浮液，記數(shù)； 〔 5〕用多聚賴氨酸液預(yù)先包被培養(yǎng)皿〔 37℃ 〕 24h，每皿 接種 106個(gè)懸浮細(xì)胞； 〔 6〕 CO2 培養(yǎng)箱孵育 2h，換無血清化學(xué)限制培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)， 4天后換液。 神經(jīng)組織 的體外培養(yǎng) 結(jié)果： 用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定證 實(shí)，大約 98%的細(xì)胞是神經(jīng)元性質(zhì)的細(xì)胞。 硼酸鹽緩沖液配制的 多聚賴氨酸生長基質(zhì)，其效果好于 蒸餾水。 器官培養(yǎng) 概述： 器官培養(yǎng)：主要采用類似于組織培養(yǎng)中植塊培養(yǎng)的方式 培養(yǎng)器官型植塊。 開展歷史：最早 Leob〔 1897年〕進(jìn)行成年兔一些器官的 嘗試性培養(yǎng) —— 血漿凝快培養(yǎng)兔的肝、腎、甲狀腺、卵巢等 〔 3天〕； 20世紀(jì)初器官培養(yǎng)進(jìn)入活潑時(shí)期〔主要限于胚胎器 官〕； 20世紀(jì) 50年代進(jìn)入蓬勃開展階段〔不限于胚胎器官〕， 技術(shù)、器皿、培養(yǎng)基等有了許多改進(jìn)和革新。 .1 器官培養(yǎng) 概述 迄今，文獻(xiàn)報(bào)道已在培養(yǎng)的人體器官：乳腺、眼、 內(nèi)耳、肝、腦、角膜、腎、肺、骨、皮膚、子宮、胸 腺、腸、牙、氣管、副甲狀腺、心臟、食管等等。 第八十九頁，共一百一十二頁。器官保存無 細(xì)胞增殖。如肝、肺的一葉，一片皮膚等。 〔 3〕器官培養(yǎng)無器官數(shù)量的增加。 第九十頁，共一百一十二頁。 胚胎器官培養(yǎng)的特點(diǎn)： 〔 1〕能量來源是糖酵解，培養(yǎng)時(shí)不需補(bǔ)充 O2。 〔 3〕胚胎器官細(xì)胞生長活潑，遷移能力強(qiáng)，容易 從植快中遷移出來。 胚胎與成體器官培養(yǎng)的特點(diǎn) 成體器官培養(yǎng)的特點(diǎn)： 〔 1〕能量來自有氧代謝，因此需充足的 O2供給， 器官植塊中心才不會(huì)缺氧而壞死。 〔３〕器官內(nèi)部細(xì)胞遷移不明顯。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 表玻璃器官培養(yǎng)法： Ｆ ell 和 Robinson〔 1929〕建立。 已成功用于研究胚胎原基的形態(tài)發(fā)生，改進(jìn)后可用 于激素、維生素、致癌因子對(duì)哺乳動(dòng)物成年器官的作 用等方面的研究。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 瓊脂凝膠培養(yǎng)法： 培養(yǎng)液加瓊脂形成凝膠，故培養(yǎng)基質(zhì)不液化，器官 組織的細(xì)胞在其上的遷移受到抑制。 第九十四頁，共一百一十二頁。 器官型植塊置于液體培養(yǎng)基中，適當(dāng)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶， 以使液面的氧盡可能多地溶解在培養(yǎng)液中，并防止植 快下沉而黏附。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 直接漂浮培養(yǎng)法： 器官浸入培養(yǎng)液中，不能持續(xù)接觸空氣〔 O2〕易 于缺氧壞死。 此法適合于高耗氧的成體器官的培養(yǎng)。 第九十六頁，共一百一十二頁。 最早的在氣 — 液外表進(jìn)行器官培養(yǎng)的方法。 第九十七頁，共一百一十二頁。 金屬格柵替代漂浮支持物〔 Trowell,1954〕。 金屬格柵：堅(jiān)實(shí)、平穩(wěn)、平安，支托或移動(dòng)大量 的培養(yǎng)器官。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 瓊脂小島器官培養(yǎng)法： 瓊脂制成小島狀的支持物，放在液體培養(yǎng)基中， 將器官置于瓊脂上進(jìn)行培養(yǎng)。 優(yōu)點(diǎn)：可直接觀察器官的生長情況；維持器官在 體外較長時(shí)間生長、抑制細(xì)胞遷移〔瓊脂凝膠培養(yǎng)法 的優(yōu)點(diǎn)〕；換液簡便〔液體培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)〕。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法： 最早于 1933年〔 Gey〕建立。 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)期間，植塊斷續(xù)地與培養(yǎng)液和氣相接觸， 可獲得充足的營養(yǎng)和氧氣。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 搖擺式器官培養(yǎng)法： 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法雖是動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，但操作復(fù)雜。 第一百零一頁，共一百一十二頁?？諝馔? 過過濾器進(jìn)入儲(chǔ)液罐對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行充氧和穩(wěn)定 pH。 優(yōu)點(diǎn)： 系統(tǒng)簡單易行、可達(dá)很好的無菌效果、適 合器官的長期培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物連續(xù)收集。 1938年，卡雷爾和林德伯格嘗試了采用無菌循環(huán)裝 置培養(yǎng)貓的甲狀腺，并維持?jǐn)?shù)星期。 目前，器官灌流技術(shù)應(yīng)用于器官培養(yǎng)已取得了良好 效果。 第一百零三頁，共一百一十二頁。 器官培養(yǎng)應(yīng)用舉例 軟骨的培養(yǎng)： 軟骨培養(yǎng)常用于研究軟骨與骨的生長分化及影響因 素。軟骨培養(yǎng)可采用旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)法、 血漿凝塊培養(yǎng)法和金屬格柵培養(yǎng)法。 第一百零五頁，共一百一十二頁。 2. 用小鑷子在骶關(guān)節(jié)處解離雞胚下肢。 4. 將股骨植塊植于培養(yǎng)管的血漿上，每隔約 15分 鐘可放入一個(gè)股骨，加塞，室溫靜止 1~2小時(shí)。結(jié)果：股骨增長增粗，軟骨 細(xì)胞肥大。 神經(jīng)組織的器官培養(yǎng) 1985年，斯坦斯維格成功建立了大鼠胚胎腦組織的 培養(yǎng) —— 半固體瓊脂包埋靜止培養(yǎng)法。 具體操作步驟： 1. 乙醚麻醉懷孕大鼠，消毒、固定開腹取子宮于培 養(yǎng)皿中，開子宮取出鼠胎。切成小立方塊〔 〕。存活期可達(dá) 50天，發(fā)育與體內(nèi)相似。 血管的培養(yǎng) 血管醫(yī)學(xué)研究在血管發(fā)育、損傷、修復(fù)、再生等方 面具有重要意義。懸浮孵育法 培養(yǎng)具體操作如下： 培養(yǎng)基：血漿、 199和 DEM培養(yǎng)基。 1〕 —— 乙醚麻醉大鼠，消毒開胸，剪取胸動(dòng)脈，培 養(yǎng)液沖洗血管內(nèi)壁，剪成 。 3〕放入培養(yǎng)箱中 37℃ 培養(yǎng)。 肝臟的培養(yǎng)： 體外培養(yǎng)肝臟在研究肝臟生理病理過程及其機(jī)制方面有重大 意義。 1〕拉頸處死 13日齡大鼠，消毒，取出肝臟，置于含培養(yǎng)液 的培養(yǎng)皿中。 3〕給 Conway微擴(kuò)散單位裝置中央孔內(nèi)加滿培養(yǎng)液，消 毒濾紙蓋住中央孔。 5〕 9~10個(gè)微擴(kuò)散裝置放入密閉小室內(nèi)，沖入 95%的 O2和 5%的 CO2的混合氣體， 37度培養(yǎng)。 第一百零九頁，共一百一十二頁。 最新進(jìn)展 名副其實(shí)的備用人體器官將在數(shù)年內(nèi)由實(shí)驗(yàn)室走向 患者。美 國密執(zhí)安大學(xué)開發(fā)生物工程人造腎。 我國該領(lǐng)域的工作，取得了極有價(jià)值成果，我國曹 誼林教授在裸鼠背上復(fù)制人耳，引起國際巨大反響。如可導(dǎo) 電聚合物、膀胱、〔人眼角膜細(xì)胞培育〕人造角膜。 內(nèi)容總結(jié) 第四章 動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng) (Animal Cell and Tissue Culture)。 3~6層空心纖維構(gòu)成培養(yǎng)系統(tǒng)，細(xì)胞接種于空心纖?；钜蜃印?MAN〕、 T細(xì)胞替代因子 (TRF)等。肌肉組織培養(yǎng)：肌肉組織植快或分散的肌細(xì)胞在離體環(huán)境中。