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體外培養(yǎng)細胞的生長與增殖過程(存儲版)

2025-10-04 11:54上一頁面

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【正文】 天是細胞增殖的主要時期,無明顯細胞融合;50~52 h 后,細胞進入快速融和期;多核細胞快速生長導致纖維網的形 成;數天后融合結束,之后可觀察到纖維的自發(fā)收縮現象;再 過 1~2天,骨骼肌細胞的特征橫紋開始變得明顯;有時肉眼可 見到細胞收縮;適當條件下,細胞增殖一代時間為 11~13 h。 第八十五頁,共一百一十二頁。 根本技術特點:取出動物器官或進一步修整成器官型植 塊,將其接種到培養(yǎng)基上或培養(yǎng)液中,在適當的營養(yǎng)、氣相、 生長基質等條件下,使其存活和生長。 〔 2〕被培養(yǎng)物是完整器官或具有完整功能的某一 器官的一局部。 〔 2〕早期胚胎器官〔原基〕體積較小,可將整個 器官進行培養(yǎng)。表玻璃上加雞胚 質和雞血漿 → 凝固 → 培養(yǎng)的器官移植其上 → 放入培養(yǎng) 皿內 → 入箱培養(yǎng)。 第九十五頁,共一百一十二頁。 擦鏡紙〔具有疏水性〕漂浮在培養(yǎng)液的外表,作 為器官的支持物,營養(yǎng)物可透過擦鏡紙進入器官。瓊脂起支持和防止培養(yǎng) 器官的細胞發(fā)生遷移的作用。 1976年〔 Barret等〕創(chuàng)立搖擺式器官培養(yǎng)法:采 用平臺式搖擺儀使培養(yǎng)的器官植塊交替地浸入培養(yǎng)液 和暴露于混合氣體環(huán)境中,還能迅速去除器官的代謝 產物,器官的存活時間較長。他們用泵將營養(yǎng) 液泵入器官內,并經過器官循環(huán)后流出,這是最早的 灌注式培養(yǎng)器官的嘗試。 培養(yǎng)液: 199或 Earle(MEM),加 20%小牛血清、葡 萄糖 4mmol∕ml 、 。 第一百零六頁,共一百一十二頁。 第一百零七頁,共一百一十二頁。 第一百零八頁,共一百一十二頁。每天換氣、液一次。 其他生物工程人體器官也在加緊“制造〞中?!?1〕 3T3細胞的傳代培養(yǎng):小鼠胚胎瘤成纖維細胞系 3T3 →。去除小球中的冰晶,成多孔性小球。卡羅來納醫(yī)學中 心的生物工程學家設計和培育成功了人體乳房組織。 4〕 2~3塊肝臟植塊置于中央孔外表濾紙上,用毛玻璃片蓋好 裝置。 2〕將動脈管置于培養(yǎng)瓶中,參加培養(yǎng)液。 ,植入植塊,再加 1ml 培養(yǎng)液,加蓋, 37度、飽和濕度、 5%CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。 5. 培養(yǎng)管中加 2ml培養(yǎng)液,加棉塞入 CO2 培養(yǎng)箱 中的旋轉孔內培養(yǎng);轉鼓傾斜: 5~12度,轉速: 5~ 12rph; 2~3天換液一次。材料常用胚胎動物長骨〔最常用雞胚長骨〕取材 時注意動物的年齡。 第一百零二頁,共一百一十二頁。 第一百頁,共一百一十二頁。 第九十八頁,共一百一十二頁。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 擦鏡紙培養(yǎng)法: 直接漂浮培養(yǎng)法的缺乏:器官易轉曲。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 懸浮培養(yǎng)法: 是最簡便最早使用的液體培養(yǎng)法,可隨時加影響因 子或生化分析〔瓊脂凝膠培養(yǎng)法只有在轉培養(yǎng)時才能 進行〕。 第九十二頁,共一百一十二頁。 胚胎與成體器官培養(yǎng)的特點 根本原那么: 〔 1〕提供充足的營養(yǎng)和 O2,及時排除代謝廢物; 〔 2〕抑制細胞從植快向外遷移。 .1 器官培養(yǎng)概述 器官培養(yǎng)的特征: 器官培養(yǎng)與器官保存、組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)不同: 〔 1〕被培養(yǎng)器官存活較長時間,保持相對正常功 能,器官內的細胞有正常功能甚至增殖。 第八十七頁,共一百一十二頁。 差速處理富集脊髓神經元培養(yǎng)法: 材料: 動物:胚齡 14天的大鼠胚胎; 培養(yǎng)液:〔 1〕含血清的培養(yǎng)液: DMEM加20%胎 牛血清、 50 IU∕ml的青霉素、 50μg ∕ml 的鏈霉素 〔 2〕無血清的培養(yǎng)液: DMEM 加 5μg ∕ml 牛胰島 素、 50 μg ∕ml 人轉鐵蛋白?!?3〕取原代或傳代培養(yǎng)的細胞記數,接種在明 膠覆蓋的培養(yǎng)板上,進行骨骼肌細胞的培養(yǎng)。 肌衛(wèi)細胞:乃骨骼肌細胞的干細胞〔可被看作儲藏 的成體細胞〕。 結果分析: 角質形成細胞培養(yǎng) 3~5天后開始形成集落、擴展; 10天左右集落融合形成皮片,細胞增速減慢; 3T 3漸被排擠,形成整個皮片時, 3T3細胞消失。 飼養(yǎng)層細胞: 瑞士小鼠胚胎瘤的成纖維細胞系 3T3,能有 力促進表皮細胞的貼壁生長,抑制混入的成纖維細胞生長。 組織培養(yǎng) 上皮組織的體外培養(yǎng) 肌肉組織的體外培養(yǎng) 神經組織的體外培養(yǎng) 第七十五頁,共一百一十二頁。 第七十二頁,共一百一十二頁。 ,包括新型的無菌生 物反響器培養(yǎng)系統(tǒng)與工藝、先進的在線監(jiān)測、分析與 自動控制技術等。 、長時間培養(yǎng)過程中分泌產物能 力易喪失,或產物活性易降低。 細胞系或細胞珠不同,其無血清培養(yǎng)基需求不同, 在細胞早期培養(yǎng)階段,細胞對無血清培養(yǎng)基的適應性 往往是特異性的。 第六十五頁,共一百一十二頁。對細胞有潛在損傷。應防止培養(yǎng)基中 Gln自然分解和盡量去除培養(yǎng)基中的氨。 多肽生長因子:神經生長因子〔 NGF〕、成纖維 細胞生長因子〔 FGF〕、表皮生長因子〔 EGF〕、血 清生長因子〔 SF〕等。 國外,氣升式反響器已放大到 5 000~10 000L,攪 拌式反響器到達 8 000L。 : 成球材料溶于水溶液 → 銳 孔噴射成小液滴 → 低溫疏水性物質中 → 遇冷凝固 → 含冰晶的固體小球 → 物理化學方法固化成球材料 → 去除小球中的冰晶,成多孔性小球。 多孔微載體的制備 成球材料 分散 介質 成 球 成孔 去除球中的成孔物質 后期處理 多孔微載體 第五十三頁,共一百一十二頁。 微多孔載體培養(yǎng)技術 傳統(tǒng)實心微載體的缺乏:只能固定貼壁細胞、后期 細胞老化而脫落、貼壁需血清中的因子幫助。微囊材料:海藻酸〔 1,4鍵連接的多 聚甘露糖醛酸和古羅糖醛酸〕、多聚賴氨酸。 但:勞動強度大、滾瓶空間大而提供的面積有限、細 胞產率低、監(jiān)控不便。 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術 在貼壁和懸浮培養(yǎng)發(fā)根底根底上,融合固定化 細胞、流式細胞術、填充床、生物反響器和人工灌 流等技術而開展起了動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術。最早采用的是 Carrel〔 1923年〕設計 的卡氏瓶??蓪⑴囵B(yǎng)物 接種在載玻片上,再入旋轉管培養(yǎng),取載玻片觀察。 第三十七頁,共一百一十二頁。 〔 4〕微載體:天然葡聚糖和其他天然或合成聚合物 第三十六頁,共一百一十二頁。 原代培養(yǎng) 培養(yǎng): 接種:接種量大小視情況而定;防污染;常規(guī)檢 查: 12天做一次。 培養(yǎng)條件 —— 培養(yǎng)基 無血清培養(yǎng)基的添加成分: 〔 1〕細胞外基質〔 extracellular matrix,ECM〕: 促進貼壁。低限量根底培養(yǎng)基主要含:無機鹽、微 量元素、氨基酸、維生素、碳水化合物等。 〔 4〕水解乳蛋白:氨基酸含量高。 種類:生物性液體〔如血清〕、組織浸液〔如胚胎 浸液〕、凝固劑〔如血漿〕等。 培養(yǎng)條件和工具 一、培養(yǎng)條件: 1. 溫度: 2. pH: 3. 氣體: 4. 營養(yǎng): 二、培養(yǎng)工具: 1. 器皿: 2. 載體: 第二十七頁,共一百一十二頁。 衰亡期〔 senescence〕:營養(yǎng)物的耗盡和有害 物質的作用,細胞死亡數大于細胞分裂數。 細胞分裂指數〔 mitotic index, MI〕 : MI=(分裂相個數 ∕1000個細胞 ) 100% 。連續(xù)細胞系〔株〕:主要發(fā)生在傳代期。 細胞:移動活潑、分裂但不旺盛、相似于〔也能 代表〕體內組織、藥物測試的好對象。 第十六頁,共一百一十二頁。 第十四頁,共一百一十二頁。 如神經元和神經膠質細胞 第十二頁,共一百一十二頁。起源于內、外 胚層的細胞體外培養(yǎng)時如此。從生長外表脫落而進入液體 的細胞通常不再生長而逐漸退化。 貼附和非貼附生長: :細胞間相互接觸;細胞與細胞外基 質〔培養(yǎng)器皿壁或載體〕結合。 ,生長緩慢,易受污染。 第五頁,共一百一十二頁。 先驅者中法國學者卡勒爾:設計卡氏培養(yǎng)瓶自 1923年用于培養(yǎng)雞胚的心肌組織成功以后,已使 多種動物組織培養(yǎng)獲得成功。 是動物細胞工程的重要技術根底:細胞融合、組織 工程、胚胎工程、干細胞工程、動物克隆、動物細胞 產品的大規(guī)模制備技術等等都離不開~。 20世紀 80年代以后: 隨著基因工程技術和細胞融合技術的迅速發(fā) 展,已能把特定的外源基因通過 PCR技術擴增幾 千倍,并可轉染到細胞內,使其得到高質量的表 達。 : 2030nm間隔,有橫隔。 50代左右即退化死亡。如:白細胞、淋巴細胞,腫瘤 細胞、雜交瘤細胞、轉化細胞系等。 起源于中胚層的細胞在體外培養(yǎng)時一般表現為這種形式。 分散生長,不連接成片,成群落;通常伸出偽足和 突起,貼壁位置不固定,呈活潑的游走和變形運動。 第十三頁,共一百一十二頁。 第十五頁,共一百一十二頁。 如:人胚成纖維細胞存活一年、傳 30~50代相當于 150~300個細胞周期〕;供體是成體或衰老個體時那么 存活更短;肝、腎細胞僅能傳幾代或十幾代。細胞的代數 =轉 接的次數。 亞株〔 substrain〕:? 第十九頁,共一百一十二頁。 每代〔群體〕細胞的生長過程 在理想的環(huán)境下,細胞處于較恒定的生長分裂狀 況,其生長速率: dN ∕dt = μN 〔 N—— 時間 t 時的細胞個數; μ—— 細胞比生長速率:在對數生 長期,群體細胞數增殖一倍所需要的時間,以時間 T 表示〕 積分得: T = ㏑ 2 ∕μ (時間 T表示細胞比生長 速率 ) 此時期細胞以指數形式增長繁殖。 細胞濃度的對數 潛伏期 對數生長期 穩(wěn)定期 衰亡期 0 24 48 72 96 120 h 每代〔群體〕細胞生長的四個時期 第二十四頁,共一百一十二頁。 pH:最適 ~,低于 高于 至死亡。含各種血漿蛋 白、多肽、脂肪、碳水化合物、激素、生長因子及無 機物等,在生理平衡下促進或抑制細胞生長。 培養(yǎng)條件 —— 培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基〔 synthetic medium〕:給細胞提供近 似體內的生理環(huán)境,且便于控制和標準化。 培養(yǎng)條件 —— 培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基: 〔 2〕無血清培養(yǎng)基〔 se
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