【正文】 飼養(yǎng)層細(xì)胞： 瑞士小鼠胚胎瘤的成纖維細(xì)胞系 3T3，能有 力促進(jìn)表皮細(xì)胞的貼壁生長，抑制混入的成纖維細(xì)胞生長。 培養(yǎng)過程： 〔 1〕 3T3細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：小鼠胚胎瘤成纖維細(xì)胞系 3T3 → PBS平衡液洗滌 → 胰蛋白酶 EDTA消化 → 細(xì)胞變圓〔顯微鏡 下觀察〕 → 棄消化液，加角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液〔消化液體積的 3倍〕 → 吹打分散細(xì)胞 → 接種培養(yǎng)， 3~5天發(fā)生融合 → 接近融合 成單層時 → 傳代培養(yǎng)。 結(jié)果分析： 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng) 3~5天后開始形成集落、擴(kuò)展； 10天左右集落融合形成皮片，細(xì)胞增速減慢； 3T 3漸被排擠，形成整個皮片時， 3T3細(xì)胞消失。 肌肉組織培養(yǎng)：肌肉組織植快或分散的肌細(xì)胞在離體環(huán)境中 存活、生長或發(fā)育。 肌衛(wèi)細(xì)胞：乃骨骼肌細(xì)胞的干細(xì)胞〔可被看作儲藏 的成體細(xì)胞〕。 第八十二頁，共一百一十二頁?！?3〕取原代或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞記數(shù)，接種在明 膠覆蓋的培養(yǎng)板上，進(jìn)行骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)?！膊煌M織來源的細(xì)胞連續(xù)傳 代會導(dǎo)致生長增殖活動停止，也有肌源性表型喪失的趨勢〕 第八十四頁，共一百一十二頁。 差速處理富集脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)法： 材料： 動物：胚齡 14天的大鼠胚胎； 培養(yǎng)液：〔 1〕含血清的培養(yǎng)液： DMEM加20%胎 牛血清、 50 IU∕ml的青霉素、 50μg ∕ml 的鏈霉素 〔 2〕無血清的培養(yǎng)液： DMEM 加 5μg ∕ml 牛胰島 素、 50 μg ∕ml 人轉(zhuǎn)鐵蛋白。 第八十六頁，共一百一十二頁。 第八十七頁，共一百一十二頁。 第八十八頁，共一百一十二頁。 .1 器官培養(yǎng)概述 器官培養(yǎng)的特征： 器官培養(yǎng)與器官保存、組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)不同： 〔 1〕被培養(yǎng)器官存活較長時間，保持相對正常功 能，器官內(nèi)的細(xì)胞有正常功能甚至增殖。組織 培養(yǎng)物已喪失原器官的完整功能。 胚胎與成體器官培養(yǎng)的特點(diǎn) 根本原那么： 〔 1〕提供充足的營養(yǎng)和 O2，及時排除代謝廢物； 〔 2〕抑制細(xì)胞從植快向外遷移。 第九十一頁，共一百一十二頁。 第九十二頁，共一百一十二頁。 第九十三頁，共一百一十二頁。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 懸浮培養(yǎng)法： 是最簡便最早使用的液體培養(yǎng)法，可隨時加影響因 子或生化分析〔瓊脂凝膠培養(yǎng)法只有在轉(zhuǎn)培養(yǎng)時才能 進(jìn)行〕。 器官型植塊置于液體培養(yǎng)基與氣象界面上培養(yǎng)， 植塊可同時獲取營養(yǎng)和充足的氧氣。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 擦鏡紙培養(yǎng)法： 直接漂浮培養(yǎng)法的缺乏：器官易轉(zhuǎn)曲。 傳統(tǒng)的器官培養(yǎng)方法 金屬格柵器官培養(yǎng)法： 漂浮支持物很難持久地漂浮。 第九十八頁，共一百一十二頁。 第九十九頁，共一百一十二頁。 第一百頁，共一百一十二頁。 現(xiàn)代器官培養(yǎng) — 灌流式器官培養(yǎng)法 培養(yǎng)系統(tǒng)的特征： 采用一個連有傾斜注射器外套的培養(yǎng)容器，新鮮 培養(yǎng)液從儲液罐通過注射器不斷流入培養(yǎng)容器，液體 由外套的出口端流出，其流速由恒流泵控制。 第一百零二頁，共一百一十二頁。陳細(xì)華等采用長時間灌流式器官培養(yǎng)方法進(jìn)行 了草魚腦垂體的完整器官長期培養(yǎng)， 82天內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn) 污染，腦垂體保持正常的生長素分泌能力。材料常用胚胎動物長骨〔最常用雞胚長骨〕取材 時注意動物的年齡。 軟骨的培養(yǎng)：雞胚長骨培養(yǎng)的操作過程： 1. 消毒孵化〔 8~9d〕蛋，取出雞胚，洗凈。 5. 培養(yǎng)管中加 2ml培養(yǎng)液，加棉塞入 CO2 培養(yǎng)箱 中的旋轉(zhuǎn)孔內(nèi)培養(yǎng)；轉(zhuǎn)鼓傾斜： 5~12度，轉(zhuǎn)速： 5~ 12rph； 2~3天換液一次。 培養(yǎng)基： DMEM，加小牛血清，青、鏈霉素。 ，植入植塊，再加 1ml 培養(yǎng)液，加蓋， 37度、飽和濕度、 5%CO2培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。血管的培養(yǎng)方法很多。 2〕將動脈管置于培養(yǎng)瓶中，參加培養(yǎng)液。 1983年〔 Hart 和 Conway〕微擴(kuò)散單位裝置培養(yǎng)新生大 鼠的肝臟獲得成功。 4〕 2~3塊肝臟植塊置于中央孔外表濾紙上，用毛玻璃片蓋好 裝置。 1 2 3 4 5 Conwey微擴(kuò)散單位裝置示意圖 4. 199培養(yǎng)液 5. 微擴(kuò)散單位底部 第一百一十頁，共一百一十二頁?？_來納醫(yī)學(xué)中 心的生物工程學(xué)家設(shè)計和培育成功了人體乳房組織。 第一百一十一頁，共一百一十二頁。去除小球中的冰晶，成多孔性小球。如可導(dǎo) 第一百一十二頁，共一百一十二頁?！?1〕 3T3細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：小鼠胚胎瘤成纖維細(xì)胞系 3T3 →。血清的使用影響實驗結(jié)果〔原因與結(jié)果難以對應(yīng)〕。 其他生物工程人體器官也在加緊“制造〞中。美國杜克大學(xué)的勞拉已經(jīng)把人體器官細(xì)胞生長 技術(shù)應(yīng)用在豬身上，最終目標(biāo)是培養(yǎng)出人體動脈。每天換氣、液一次。 2〕消毒紙上切成 3mm3小塊，用培養(yǎng)液輕輕清洗。 第一百零八頁，共一百一十二頁。合成培養(yǎng)基中 加胎牛血清和青、鏈霉素。 第一百零七頁，共一百一十二頁。 2. 剪開鼠胎的顱蓋骨，取出腦組織置 PBS的培養(yǎng)皿 中，獲得腦葉。 第一百零六頁，共一百一十二頁。 3. 顯微鏡〔或放大鏡〕除去軟骨周圍的軟組織和 兩端的結(jié)構(gòu)，保存完整的股骨的結(jié)構(gòu)；用目鏡標(biāo)尺測 定股骨長度，用 Hanks液洗一次。 培養(yǎng)液： 199或 Earle(MEM)，加 20%小牛血清、葡 萄糖 4mmol∕ml 、 。 1 2 3 4 5 6 7 3 4 5 8 9 10 15 11 12 13 14 一種長時間灌流式器官培養(yǎng)裝置圖 第一百零四頁，共一百一十二頁。他們用泵將營養(yǎng) 液泵入器官內(nèi)，并經(jīng)過器官循環(huán)后流出，這是最早的 灌注式培養(yǎng)器官的嘗試。樣 品從樣品收集口收集。 1976年〔 Barret等〕創(chuàng)立搖擺式器官培養(yǎng)法：采 用平臺式搖擺儀使培養(yǎng)的器官植塊交替地浸入培養(yǎng)液 和暴露于混合氣體環(huán)境中，還能迅速去除器官的代謝 產(chǎn)物，器官的存活時間較長。 要培養(yǎng)的器官植塊用血漿凝塊固定于旋轉(zhuǎn)管一側(cè)， 管內(nèi)參加適量培養(yǎng)液，水平旋轉(zhuǎn)進(jìn)行培養(yǎng)。瓊脂起支持和防止培養(yǎng) 器官的細(xì)胞發(fā)生遷移的作用。 最初為高耗氧的成體器官培養(yǎng)而設(shè)計。 擦鏡紙〔具有疏水性〕漂浮在培養(yǎng)液的外表，作 為器官的支持物，營養(yǎng)物可透過擦鏡紙進(jìn)入器官。如皮膚表 皮向上、真皮向下直接漂浮在培養(yǎng)液外表，并向培養(yǎng) 液中充入 70%的 O2 ，獲成功〔 Medarwar,1948〕。 第九十五頁，共一百一十二頁。 用此法成功進(jìn)行了胚胎器官的發(fā)育及形態(tài)發(fā)生的研 究，以及腫瘤組織的培養(yǎng)。表玻璃上加雞胚 質(zhì)和雞血漿 → 凝固 → 培養(yǎng)的器官移植其上 → 放入培養(yǎng) 皿內(nèi) → 入箱培養(yǎng)。 〔２〕只能成功培養(yǎng)幾周，且僅能維持其存活和保 持其結(jié)構(gòu)功能〔因其高耗氧率和細(xì)胞的高度分化〕。 〔 2〕早期胚胎器官〔原基〕體積較小，可將整個 器官進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)有細(xì) 胞數(shù)量的增加。 〔 2〕被培養(yǎng)物是完整器官或具有完整功能的某一 器官的一局部。 現(xiàn)代器官培養(yǎng)的共同點(diǎn)： 〔 1〕培養(yǎng)對象：非胚胎和胚胎器官的一局部； 〔 2〕浸泡在培養(yǎng)液中培養(yǎng)； 〔 3〕被培養(yǎng)組織器官的細(xì)胞以簡單擴(kuò)散方式獲得氧 氣和其他營養(yǎng)物質(zhì)、排除 CO2和其他代謝廢物。 根本技術(shù)特點(diǎn)：取出動物器官或進(jìn)一步修整成器官型植 塊，將其接種到培養(yǎng)基上或培養(yǎng)液中，在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)、氣相、 生長基質(zhì)等條件下，使其存活和生長。 因材料來源于胚胎組織，所以培養(yǎng)物中還有少量的 神經(jīng)前體細(xì)胞。 第八十五頁，共一百一十二頁。即體外培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 骨骼肌培養(yǎng)的結(jié)果： 接種數(shù)小時后多數(shù)細(xì)胞貼壁，主要為單核〔外觀明顯〕細(xì) 胞；前 2天是細(xì)胞增殖的主要時期，無明顯細(xì)胞融合；50~52 h 后，細(xì)胞進(jìn)入快速融和期；多核細(xì)胞快速生長導(dǎo)致纖維網(wǎng)的形 成；數(shù)天后融合結(jié)束，之后可觀察到纖維的自發(fā)收縮現(xiàn)象；再 過 1~2天，骨骼肌細(xì)胞的特征橫紋開始變得明顯；有時肉眼可 見到細(xì)胞收縮；適當(dāng)條件下，細(xì)胞增殖一代時間為 11~13 h。 培養(yǎng)過程：〔 1〕處死動物，別離大腿肌肉，洗滌，胰蛋 白酶消化，收集懸浮細(xì)胞。肌肉受傷后，肌衛(wèi)細(xì)胞分裂，轉(zhuǎn)化 為肌細(xì)胞，進(jìn)一步分化為肌纖維，填補(bǔ)受傷部位。 骨骼肌細(xì)胞：中胚層細(xì)胞分化 → 成肌細(xì)胞 → 有絲分裂 →融合 → 肌管細(xì)胞〔長條管狀，十多個核串珠狀排列中間〕 →肌原纖 維增加，核向周邊移動 → 骨骼肌細(xì)胞。 肌肉組織的體外培養(yǎng) 肌肉組織的特點(diǎn)： 又稱肌組織，來自于中胚層具收縮能力的肌細(xì)胞。 〔 3〕角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代：取材消毒、別離皮膚和 皮下組織，切成 2~3mm小快 → 中性蛋白酶消化〔 4 ℃ 過夜或 37 ℃ 2~4h〕→ 針頭分開表皮〔薄而半透明〕與真皮 → 胰蛋 白酶消化、離心、培養(yǎng) → 細(xì)胞覆蓋 70%瓶底那么傳代。 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液 ： DMEM和 F12 (3﹕ 1)加 10%胎牛血 清、 4 mmol∕L谷氨酰胺、青 100IU∕ml、鏈霉素 100 μg ∕ ml、 5 μg ∕ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、 5μg ∕ml胰島素等。 第七十七頁，共一百一十二頁。 〔 2〕接觸抑制：培養(yǎng)一段時間后，細(xì)胞增多成片 后，運(yùn)動和生長受到抑制。 人們甚至正在嘗試： 培育能充當(dāng)藥物釋放渠道 的組織。 其優(yōu)勢明顯、應(yīng)用前景誘人：運(yùn)用生物工程技術(shù)， 利用人體剩余器官的少量正常細(xì)胞進(jìn)行體外繁殖，既 可獲得患者急需的具有相同功能的器官，又無排斥反 應(yīng)，現(xiàn)已取得滿意的成果。 異體移植：最難解決免疫排斥反響，失敗率極高；異體 器官來源有限，供不應(yīng)求，難以實施移植。 第七十頁，共一百一十二頁。 、大量分泌目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。 。 第六十八頁，共一百一十二頁。 動物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 〔四〕過程監(jiān)控： 因大量細(xì)胞的代謝，培養(yǎng)環(huán)境會迅速改變，過程的 再線監(jiān)控是非常重要的。 動物細(xì)胞生物反響器大規(guī)模培養(yǎng) 〔三〕培養(yǎng)基與細(xì)胞系： 培養(yǎng)基：歷經(jīng)天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基到現(xiàn)今的無 血清培養(yǎng)基。 bel2基因的過量表達(dá)：能抑制 Gln或缺氧引起的細(xì) 胞調(diào)亡、減少細(xì)胞特定成分的消耗、提高細(xì)胞密度和 目的蛋白的產(chǎn)量。滲透壓保護(hù)劑：甘氨酸、甜菜堿 和三甲基甘氨酸或脯氨酸可一定程度保護(hù)高滲對細(xì)胞生長的抑 制作用，并不影響目的蛋白的表達(dá)水平，還可使細(xì)胞長時