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2024-10-22 20:21本頁面
【正文】 rsification: 在此步驟中常用的技術(shù)是易錯(cuò) PCR和 DNA改組。 ? 擴(kuò)增， Amplification:確定的突變復(fù)制擴(kuò)增，了解 DNA序列的突變。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將執(zhí)行一個(gè)以上的回合。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束，蛋白質(zhì)或 RNA突變采用生化方法鑒定。 定向進(jìn)化與自然進(jìn)化的差別 定向進(jìn)化的一般過程 酶 定向進(jìn)化的意義 ? 酶作為生物催化劑其專一性和高效性是一般催化劑所不能比擬的，但是天然酶的許多性質(zhì)不適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的條件。 酶分子定向進(jìn)化的歷史 ? Sol Spiegelman在 20世紀(jì) 60年代利用 RNA噬菌體 Q進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，是第一次在分子水平上定向改造單一分子。 ? 1993年， Arnold研究組提出易錯(cuò) PCR的方法。 ? 1999年， Stemmer等把 DNA改組延伸到族改組。這個(gè)過程可通過靈敏的篩選方法，選擇陽性突變子。 多樣性的產(chǎn)生 定向進(jìn)化的策略 ?無性進(jìn)化 易錯(cuò) PCR、化學(xué)誘變劑介導(dǎo)的隨機(jī)誘變、 由致突變菌株產(chǎn)生的隨機(jī)突變 ?有性進(jìn)化 DNA改組技術(shù)、隨機(jī)引物體外重組法、交錯(cuò)延伸法 易錯(cuò) PCR(errorprone PCR) ? 一種相對(duì)簡(jiǎn)單、快速廉價(jià)的隨機(jī)突變方法 ? 通過改變 PCR反應(yīng)條件，使擴(kuò)增的基因出現(xiàn)少量堿基錯(cuò)配，從而導(dǎo)致目的基因的隨機(jī)突變。 ? 此法的不足之處： ? 靶序列長(zhǎng)度一般在 ，應(yīng)用范圍有限； ? 中性突變較多； ? 較為耗時(shí)、費(fèi)力； ? 獲得的 DNA序列中堿基的轉(zhuǎn)換高于顛換。 易錯(cuò) PCR 連續(xù)易錯(cuò) PCR (Sequential errorprone PCR) ? 該方法是將一次 PCR 擴(kuò)增得到的有益突變基因作為下一次 PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)進(jìn)行隨機(jī)誘變，使得每一次獲得的少量突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。 ? 通過改變單個(gè)基因（或基因家族）原有的核苷酸序列創(chuàng)造新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新功能。 特點(diǎn) 改組基因的效率高 提高基因突變機(jī)率 基因家族改組 隨機(jī)引物體外重組法 (RPR) 交錯(cuò)延伸原理 DNA改組與常規(guī)定向進(jìn)化的比較 基因文庫的構(gòu)建 ? 構(gòu)建理想的基因文庫要考慮的因素： ? 基因文庫的質(zhì)量 ? (1) 文庫的代表性 ? (2) 突變基因片段的序列完整性 ? 文庫篩選可選擇的方法 ? 控制突變庫的大小與特定的篩選容量相適應(yīng) 突變體基因的構(gòu)建策略 ? DNA隨機(jī)酶切，片段拼接 ? 單鏈 DNA隨機(jī)拼接（提高不同親代基因的同源片段重組形成嵌合體基因的效率） ? 限制性酶切片段隨機(jī)拼接（防止 P
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