蛋白質(zhì)工程ppt課件-閱讀頁
2024-09-30 20:21本頁面
【正文】 CR擴(kuò)增產(chǎn)生相同的親代基因） 構(gòu)建突變基因文庫的載體系統(tǒng) ? 噬菌體載體系統(tǒng)基因文庫： ?構(gòu)建中最早使用 ?插入片段的裝載容量大，適合大片段克隆 ?構(gòu)建出的基因文庫質(zhì)量高、代表性好 ?適合長(zhǎng)期保存 ?主要缺點(diǎn)是構(gòu)建成基因文庫后，可采用的文庫篩選方法有限 質(zhì)粒載體系統(tǒng) ? 質(zhì)粒載體系統(tǒng)： ? 優(yōu)點(diǎn) ?體外操作簡(jiǎn)便， ?載體本身的設(shè)計(jì)上有很大可塑性 ?能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因文庫的功能性篩選 ? 缺點(diǎn) ?插入片段的載體容量較小，含有長(zhǎng)片段的重組克隆在文庫的群體擴(kuò)增過程中容易丟失 ?轉(zhuǎn)化效率普遍較低 ?不適合文庫的長(zhǎng)期保存 文庫的篩選 ? 建立有效的搜索文庫的方法是影響定向進(jìn)化成功與否的關(guān)鍵 ? 采用的定向篩選方法必須靈敏，且應(yīng)與目的性質(zhì)相關(guān) ? 借助檢測(cè)儀器易實(shí)現(xiàn)高通量篩選 定向進(jìn)化的篩選 ? 活體篩選法 基于表形觀察的篩選 ? 基于基因編碼蛋白質(zhì)的檢測(cè)篩選表達(dá)文庫 ? 噬菌體顯示法； ? 細(xì)胞表面顯示法（細(xì)菌、纖毛蟲細(xì)胞表面） ?篩選方法根據(jù)各個(gè)蛋白質(zhì)的性質(zhì)而設(shè)，篩選方法根據(jù)各個(gè)蛋白質(zhì)的性質(zhì)而設(shè)因此，不具有通用性。 ?為加快分離目的基因的過程，已建立起多種在基因發(fā)現(xiàn)上具有“高通量”性能的篩選方法。 ? 微球細(xì)胞固定法與數(shù)字成像系統(tǒng)結(jié)合 ， 將單個(gè)細(xì)胞附著在單個(gè)固體珠上，突變體進(jìn)行分離和篩選。 酶活力檢測(cè) ? 反應(yīng)產(chǎn)物： 顯色 pH指示劑顯色 pH指示劑顯色，分光光度計(jì)和熒光酶標(biāo)儀 ? 通過檢測(cè)底物消耗或產(chǎn)物生成進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)： GC/HPLC，使用較短的柱子以縮短分析時(shí)間 ? 同位素標(biāo)記底物 ：質(zhì)譜 ? 熱力學(xué)紅外檢測(cè) 噬菌體顯示篩選模式 pH指示劑顯色高通量篩選 產(chǎn)物顯色篩選 熒光產(chǎn)物篩選 基于比色法和熒光檢測(cè) 的高通量篩選 蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用實(shí)例 ? 胰蛋白酶 ? 金屬硫蛋白 ? 人白細(xì)胞介素 2 ? 組織纖溶酶原激活因子 ? 枯草桿菌蛋白酶 組織纖維蛋白溶酶原激活因子 ? 組織纖維蛋白溶酶原激活因子 (tPA)是一種血漿糖蛋白，其功能是將單鑰活性形式的血淺纖溶酶原（ plg)激活，轉(zhuǎn)變成纖溶酶。通過改變tPA 分子中的某些糖基化的氨基酸而減少或避免糖基化，可減緩在血漿中被清除的速率，從而獲得具有更長(zhǎng)半衰期的治療藥劑。朱榴琴等人采用定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變的方法，對(duì)枯草桿菌堿性蛋白酶 E基因進(jìn)行改造，突變后的基因插入大腸桿菌 — 枯草桿菌穿梭質(zhì)粒中，在堿性和中性蛋白酶缺陷型的枯草桿菌 DBl04 中進(jìn)行表達(dá)，得到突變的堿性蛋白酶，各種突變酶具有抗氧化和增加穩(wěn)定性的特點(diǎn)，具備了工業(yè)用酶的
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