實驗二-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、酶切鑒定-在線瀏覽
2024-09-14 15:22本頁面
【正文】 200 nmol/LMgCl225 umol/L前向引物10 umol/L反向引物10 umol/LTaq 聚合酶5 U/ul模板DNA50ng/ulddH2O合計252．將Eppendorf離心管放入PCR儀反應(yīng)倉中。注意事項：1．用PCR擴增目的基因，一般多采用商品試劑盒。2．用于PCR擴增的模板DNA一定要純，以防止反應(yīng)體系被痕量非目的基因模板污染。PCR常見問題及分析1．假陽性PCR反應(yīng)十分靈敏，極微量的模板污染就可以造成假陽性的出現(xiàn)，操作人員身體表面、陽性標本、實驗室的一切試劑、器材及儀器或者其它與擴增產(chǎn)物接觸的物品都是潛在的污染源，從標本的采集、運輸、處理過程到PCR的操作應(yīng)嚴格遵守操作規(guī)程。2．假陰性假陰性在PCR反應(yīng)過程中也較容易出現(xiàn)，常見原因主要有一下幾個方面：標本處理不當造成靶DNA的丟失、降解，或者存在抑制PCR反應(yīng)的雜質(zhì)；PCR反應(yīng)體系中Taq DNA 聚合酶失活、Mg2+濃度過低或者沒有添加；引物設(shè)計不合理、存在二級結(jié)構(gòu)；PCR循環(huán)退火溫度過高或者PCR儀顯示溫度與實際運行溫度不符；PCR產(chǎn)物在鑒定的過程中沒有加入溴化乙啶或電泳時間過長等，在PCR反應(yīng)中設(shè)立陽性對照，一旦發(fā)現(xiàn)假陰性結(jié)果，從上述幾個方面分析原因。4．非特異性PCR擴增常見的造成非特異性PCR擴增的原因及相應(yīng)預(yù)防措施如下：引物特異性不高或用量過多；Taq DNA聚合酶質(zhì)量不好或者用量偏高；Mg2+濃度過高；退火溫度過低，退火以及延伸時間過長；循環(huán)次數(shù)過多。PCR污染及預(yù)防措施潛在的污染源包括待檢者、操作人員身體表面，實驗室的一切試劑、器材及儀器或其它與擴增產(chǎn)物接觸的任何東西都可能成為潛在的污染源。在專用超凈工作臺進行樣品制備，專設(shè)工作臺進行PCR操作，PCR 產(chǎn)物在另一工作臺進行結(jié)果分析；所有工作區(qū)域應(yīng)經(jīng)常使用紫外線消毒。③使用一次性Tip頭、Eppendorf管等。⑤樣品制備應(yīng)按無菌操作原則進行，避免樣品間相互污染。⑦用于PCR的加樣器絕不能用于PCR 產(chǎn)物分析。這是近年來新發(fā)展起來的避免污染的較好的方法。在以后的PCR擴增前用尿嘧啶DNA糖基化
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