第六章基因的轉(zhuǎn)移技術(shù)-在線瀏覽
2024-09-11 13:19本頁(yè)面
【正文】 進(jìn)入宿主細(xì)胞； 2) 重組 DNA分子能否自主復(fù)制 3) 標(biāo)記基因表達(dá)效率 ： 是否具有選擇壓力 ： 細(xì)胞大小，有無(wú)細(xì)胞壁，除去細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體能否易于再生 ： 儀器，載體種類等 第二節(jié) 轉(zhuǎn)化體的檢測(cè) 1. 藥物抗性檢測(cè) 如用于細(xì)菌 , 真菌 , 植物和動(dòng)物細(xì)胞的各種抗生素抗性基因 : Ampr, Kanr, Hygr, G418r, Tcr等 2. 遺傳互補(bǔ)檢測(cè) 如用于酵母菌的各種氨基酸 , 核苷酸合成酶基因 : LEU2, TRP1, TRP3, URA3等 3. 表型選擇 如用于細(xì)菌 , 植物和動(dòng)物的 LacZ, GUS等基因 。第六章 基因的轉(zhuǎn)移技術(shù) 第一節(jié) 基因的導(dǎo)入方法 所謂基因的轉(zhuǎn)移技術(shù)就是將外源目的基因或DNA片段引人受體生物或細(xì)胞并檢查其在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)結(jié)果的一種技術(shù)。 一．基因?qū)敕椒? 1．細(xì)胞融合 106 2．微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 小于或等于 106 3．染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 106利用中期染色體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)移 4．脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 約 2 104先用脂質(zhì)體包裝 DNA，然后與 細(xì)菌，植物原生質(zhì)體融合 5． 磷酸鈣沉淀介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移 103— 107 6．原生質(zhì)體融合術(shù) 約 — %溶菌酶處理細(xì)菌，再與動(dòng)物細(xì)胞，植物原生質(zhì)體融合 7．顯微注射法 約 1— 10%直接注射入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi) 顯微注射法 — 利用顯微操縱器，將 DNA直接注射到細(xì)胞核中 穿刺法 — 利用注射顯微鏡將微注射針固定，然后穿刺將 DNA注入細(xì)胞核內(nèi) 顯微注射穿刺法 8． 電脈沖介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 104利用電脈沖改變生物膜透性， DNA可直接進(jìn)入各種細(xì)胞 9． 重組 RNA病毒感染 約 10— 100%適用于動(dòng)植物細(xì)胞 10． 重組 DNA病毒感染 約 100%適用于各種細(xì)胞 11． 直接轉(zhuǎn)化法 包括： 完整細(xì)胞或原生質(zhì)體 與 DNA直接接觸， DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于細(xì)菌，酵母菌，真菌和植物細(xì)胞。 用于細(xì)菌的噬菌斑 4. 凝膠電泳 對(duì)于自主復(fù)制型載體 , 可從轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒 DNA, 然后經(jīng)過(guò)電泳法進(jìn)一步證實(shí) 5. Southern雜交 對(duì)于整合型載體 , 則應(yīng)該利用 DNA雜交法證實(shí) 第七章 基 因 表 達(dá) 第一節(jié) 研究基因表達(dá)的方法 研究基因表達(dá)應(yīng)從以下幾個(gè)方面考慮： 1） 轉(zhuǎn)錄 ：起始，延長(zhǎng)和終止。調(diào)控亦是在起始階段 4） 翻譯后修飾 ：蛋白質(zhì)的糖基化，蛋白質(zhì)水解反應(yīng)，蛋白質(zhì)的分泌等。 常用翻譯系統(tǒng)有以下幾種： 1. 兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物 (reticylocyte lysate system) 由未成熟的兔紅細(xì)胞裂解而成，該種細(xì)胞是向動(dòng)物 注射苯肼 后引起貧血產(chǎn)生的 ,向該系統(tǒng)加入血紅素基和能量物質(zhì)，裂解物中的內(nèi)源 mRNA可被翻譯成球蛋白 ，其合成速度與用完整細(xì)胞的合
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