第六章基因的轉(zhuǎn)移技術(shù)-文庫吧
2025-07-17 13:19 本頁面
【正文】 ： hnRNA 的加帽，加尾，拼接 3） 翻譯 ：起始，延長和終止。調(diào)控亦是在起始階段 4） 翻譯后修飾 ：蛋白質(zhì)的糖基化，蛋白質(zhì)水解反應(yīng)，蛋白質(zhì)的分泌等。 一．轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) 1. 體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) 1）分離 RNA聚合酶，然后在體外進(jìn)行待測 DNA的轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 2）利用全細(xì)胞抽提液，加入外源 DNA，目前使用最廣泛的抽提液來自海拉細(xì)胞和 KB細(xì)胞 3）利用具有 SP6, T3和 T7啟動子的載體轉(zhuǎn)錄插入的外源 DNA 2. 體內(nèi)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng) 先分離細(xì)胞核，再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 二．翻譯系統(tǒng) 體外翻譯系統(tǒng) （ In vitro translation system）又稱之為體外蛋白質(zhì)合成系統(tǒng) (in vitro protein synthesis system)，是一種細(xì)胞裂解物，這種系統(tǒng)只有翻譯功能，當(dāng)加入外源 mRNA，能量物質(zhì)和氨基酸，該系統(tǒng)就能合成蛋白質(zhì)，經(jīng) SDS— PAGE后可檢測出翻譯活性。 常用翻譯系統(tǒng)有以下幾種： 1. 兔網(wǎng)織細(xì)胞裂解物 (reticylocyte lysate system) 由未成熟的兔紅細(xì)胞裂解而成，該種細(xì)胞是向動物 注射苯肼 后引起貧血產(chǎn)生的 ,向該系統(tǒng)加入血紅素基和能量物質(zhì)，裂解物中的內(nèi)源 mRNA可被翻譯成球蛋白 ，其合成速度與用完整細(xì)胞的合成速度接近。 2. 小麥胚抽提物 (wheat germ extract) 該系統(tǒng)不具內(nèi)源 mRNA，屬外源 mRNA 依賴型，利用SephadexG50可減少該系統(tǒng)中的內(nèi)源氨基酸，因而可大大增加翻譯產(chǎn)物的高比活性。 由于該系統(tǒng)存在著核酸酶和蛋白酶，因此不能用于翻譯很大的 mRNA ，該系統(tǒng)僅為前一系統(tǒng)活性的 1/10。 3. 其它系統(tǒng)： 鼠骨髓瘤抽提物，艾氏腹水瘤和釀酒酵母裂解物等 。 4. 兩棲動物卵母細(xì)胞 : 翻譯效率高，翻譯產(chǎn)物穩(wěn)定，靈敏度高（ 10ng mRNA ），也可作為轉(zhuǎn)錄 — 翻譯系統(tǒng)。 微球菌核酸酶可除去內(nèi)源 mRNA，同時也不會對系統(tǒng)中的 tRNA和 rRNA 損傷過大。由于該核酸酶的活性依賴于 Ca2+，當(dāng)除去內(nèi)源 mRNA后，可用 EGTA除去 Ca2+，此系統(tǒng)仍可保持 70%的活性。 因該系統(tǒng)無內(nèi)源核酸酶和蛋白酶，可用于大分子 mRNA 的翻譯。 三．轉(zhuǎn)錄 — 翻譯系統(tǒng) 1. 原核生物系統(tǒng) 1) 體內(nèi)基因表達(dá)系統(tǒng) i. UV照射宿主系統(tǒng) (.— irradiated host system) ，宿主細(xì)胞合成大大減少，然后感染攜帶外源基因的重組 λ分子，并同時加入帶標(biāo)記氨基酸。新合成的蛋白質(zhì)用 SDS— PAGE檢查。大多數(shù)的 λ蛋白質(zhì)合成可用宿主已有的溶源化 λ或攜帶的質(zhì)粒（含有 CI基因）抑制。 ii. 小細(xì)胞系統(tǒng) (minicell system) 突變株（ min A， min B）可形成大量無核小細(xì)胞，但細(xì)胞中的質(zhì)粒 DNA可進(jìn)入小細(xì)胞，當(dāng)純化的小細(xì)胞與帶標(biāo)記的氨基酸共培養(yǎng)，質(zhì)粒上攜帶的外源基因便可獲得表達(dá)，產(chǎn)物用SDS— PAGE檢查。 (maxicell system) 對紫外光敏感的 ，損傷的DNA會被大量降解，由于質(zhì)粒 DNA分子量小，可繼續(xù)存活。加入標(biāo)記氨基酸后，質(zhì)粒上的外源基因可獲帶標(biāo)記產(chǎn)物，用SDS— PAGE分析。 2) 體外基因表達(dá)系 ，加入外源 DNA和必須因子后可得表達(dá)產(chǎn)物。 2. 真核生物系統(tǒng) 1) 哺乳動物細(xì)胞
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