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正文內(nèi)容

msc對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的影響doc-在線瀏覽

2024-08-25 22:44本頁面
  

【正文】 療發(fā)展較快,國外有人發(fā)現(xiàn)將表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)干細胞直接種植于受傷的腦組織中,能促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。誘導(dǎo)分化劑維甲酸對神經(jīng)干細胞也有誘導(dǎo)分化作用[3]。通過探索影響神經(jīng)干細胞移植,生長,分化的分子機制,結(jié)合基因工程技術(shù),將可為神經(jīng)干細胞移植治療成功創(chuàng)造條件。細胞移植雖然已被認為對于修復(fù)神經(jīng)組織是有效的治療方法,但目前使用的細胞多取自胚胎,這樣一方面細胞來源有限,另一方面存在異體免疫排斥作用。骨髓中有兩類干細胞,即造血干細胞和間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)。MSC易于從骨髓中分離,體外擴增簡單,長期培養(yǎng)過程中能保持多向分化潛能。此研究結(jié)果很好地解決了神經(jīng)干細胞來源困難的問題,為今后神經(jīng)干細移植治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病打下了基礎(chǔ)。美國171。周刊曾將人類胚胎干細胞(ES細胞)和胚胎生殖細胞(EG 細胞)建系研究成功列為20世紀末世界十大科技成就之首,并認為ES細胞和人類基因組將同時成為新世紀最具發(fā)展和應(yīng)用前景的領(lǐng)域。將MSC,神經(jīng)干細胞定向分化,移植的研究引入到HD這一小兒外科常見病的治療研究中,探索MSC,神經(jīng)干細胞克隆、定向分化、移植對于HD治療方法,可為發(fā)育生物學(xué)積累寶貴的資料;采用細胞工程原理和方法,通過MSC,神經(jīng)干細胞移植重建HD病變段的正常神經(jīng)支配方法的研究成功,在臨床上將可以讓HD患兒免于手術(shù),使HD的治療發(fā)生根本性的改觀。參考文獻(1) 陳雷玲,胡廷澤,朗詩明,等。華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2000,31(2):27427(2) Kathryn S. Embryonic stem cells used to remyelinate injured rat spinal cord neurons. Lancet, 2000, 355 (9218): 1890(3) McCaffery P, Drager UC. Regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine Growth Factor Rev. 2000, 11(3): 233249(4) Natarajan D, Grigoriou M, MarcosGutierrez CV, et al. Multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. Development, 1999,126:157168(5) 劉平,盧亦成,朱誠。中華神經(jīng)外科雜志。研究內(nèi)容:1. MSC的分離,體外克?。唬玻?MSC向神經(jīng)干細胞的轉(zhuǎn)化;3. 多種人工修飾條件下的神經(jīng)干細胞在HD動物模型(lethal spotted rat, ls/ls)無神經(jīng)節(jié)細胞腸段移植,定向分化;4. 鑒定神經(jīng)干細胞移植后HD動物模型的消化道神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)及機能。-4-2. 擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析研究方法:1. 無血清培養(yǎng),單細胞克隆技術(shù);2. mRNA差異消減顯示技術(shù);3. 原位雜交;RTPCR,免疫組化技術(shù),透射電鏡技術(shù);4. 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。第二部分:MSC分離培養(yǎng),向神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)化1. MSC分離培養(yǎng) 切取鼠一側(cè)股骨,暴露骨髓腔,用注射器抽取細胞培養(yǎng)液(DMEM/20%FBS),反復(fù)多次沖洗出骨髓細胞,用吸管反復(fù)抽吸后,F(xiàn)icoll 分離液離心分離出有核細細胞,移入T75培養(yǎng)瓶,過夜培養(yǎng),第二日將懸浮細胞移去(貼壁細胞為較純的基質(zhì)干細胞),34天更換培養(yǎng)液,當細胞融合時用胰島素/EDTA(trypsin/EDTA)處理,收獲貼壁細胞為MSC ( MSC鑒定選用CD29,CD90,CD106等標記)。3. 鑒定 A. 光鏡及電鏡下觀察轉(zhuǎn)化細胞形態(tài)改變。第三部分:神經(jīng)干細胞分離提取,體外培養(yǎng),基因轉(zhuǎn)染1. 神經(jīng)干細胞的分離和傳代 分別取鼠紋狀體和孕鼠皮層組織,吸管吹打機械分離制成單細胞懸液,利用DMEM/F12(1:1) 加B27及bFGF無血清培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng),具體參見文獻。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCXE由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子生物學(xué)國家重點實驗室提供。第四部分:神經(jīng)干細胞在無神經(jīng)節(jié)細胞段的移植,定向分化及檢測1. 神經(jīng)干細胞在HD動物模型體內(nèi)移植 按多種組合形式,利用毛細顯微注射器將經(jīng)多種形式基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細胞注射到HD無神經(jīng)—53—節(jié)細胞段;參考文獻報道進行, cell/ 。3. 移植后的神經(jīng)干細胞對HD動物模型無神經(jīng)節(jié)細胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響檢測   A.實驗動物的處理:將實驗組鼠(包括對照組)分別于不同時期斷頸處死,如移植后4周,16周,32周。B.光鏡及電鏡檢測移植處組織形態(tài)學(xué)變化。D.原位雜交,RTPCR檢測:轉(zhuǎn)染基因的表達(VMYC,EGF等),原位雜交所需探針,RTPCR引物可分別購自中山,GIBIC公司,按說明進行實驗操作。4. 神經(jīng)干細胞移植,分化的分子機制 參照文獻利用mRNA差異消減顯示技術(shù)顯示以上多種形式神經(jīng)干細胞移植,分化的差異基因,進而進行分級分段克隆。氯仿法提取RNA,DNase I 處理,紫外分光度計定量測定。( RNA,1180。C 5min,37。C溫育50min,95。5. 結(jié)合步驟3的檢測結(jié)果再進行神經(jīng)干細胞的基因轉(zhuǎn)染 同第三部份的體外基因轉(zhuǎn)染。第五部分:統(tǒng)計分析各實驗組間的數(shù)據(jù)以 均數(shù) 177。可行性分析:(1) MSC分離,體外培養(yǎng),本課題組已經(jīng)完成。(3) 神經(jīng)干細胞移植為當今各國神經(jīng)細胞工程研究重點,大量的研究文獻報道了神經(jīng)干細胞分離,培養(yǎng)的方法。(5) 在臨床及研究中對大量先天性巨結(jié)腸癥進行了觀察,有多篇相關(guān)文獻發(fā)表。-54-3.本項目的創(chuàng)新之處(1) 以往對神經(jīng)干細胞移植的研究主要局于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓損傷修復(fù)方面,雖然有類似于神經(jīng)干細胞的神經(jīng)嵴細胞修復(fù)腸神經(jīng)節(jié)缺如的文章
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