【正文】 需要說(shuō)明的其它問(wèn)題：無(wú)需要說(shuō)明的其他問(wèn)題。(2) 嚴(yán)格遵守科學(xué)基金委員會(huì)有關(guān)資助項(xiàng)目管理、財(cái)務(wù)等各項(xiàng)規(guī)定。如能獲得資助，我校將提供一切實(shí)驗(yàn)條件、人員及時(shí)間安排、相應(yīng)的配套資金等，以保證項(xiàng)目順利完成。此項(xiàng)目的提出源于申請(qǐng)者長(zhǎng)期的臨床及科研工作積累，設(shè)計(jì)科學(xué)、合理，并具有明顯的創(chuàng)新性；課題組人員組成、結(jié)構(gòu)合理、技術(shù)力量雄厚，課題組所在的研究單位實(shí)驗(yàn)條件好，同時(shí)已有初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，已有前期國(guó)家自然科學(xué)基金的支助，具備完成此項(xiàng)課題研究的條件。申請(qǐng)者工作嚴(yán)謹(jǐn)、認(rèn)真，思維敏捷，活躍在其研究領(lǐng)域的前沿，具備良好的科研素質(zhì)。申請(qǐng)者已獲得華西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位，攻讀博士期間主要從事先天性巨結(jié)腸方面的研究。已知此疾病的發(fā)生是由于多種原因使胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞在消化道移行受阻，結(jié)腸壁肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，病變結(jié)腸痙攣收縮，腸內(nèi)容物排出受阻，近端腸管繼發(fā)性擴(kuò)張形成巨結(jié)腸。推薦時(shí)，請(qǐng)認(rèn)真負(fù)責(zé)地介紹申請(qǐng)者及其項(xiàng)目組成員的業(yè)務(wù)基礎(chǔ)、研究能力、科研態(tài)度及研究條件等。如果獲得資助，我與本項(xiàng)目組成員將嚴(yán)格遵守國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定，切實(shí)保證研究工作時(shí)間，按計(jì)劃認(rèn)真開(kāi)展研究工作，按時(shí)報(bào)送有關(guān)材料。另附該已結(jié)題項(xiàng)目《研究工作總結(jié)摘要》（300字）及已發(fā)表主要相關(guān)論文首頁(yè)復(fù)印件（限三篇）。開(kāi)支范圍詳見(jiàn)《國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目財(cái)務(wù)管理辦法》第二章。出版者頁(yè)碼 專著：作者年份題目主要設(shè)備及實(shí)驗(yàn)條件包括：１． 掃描、透射電鏡２． 高壓液相色譜儀３． 顯微成像系統(tǒng)４． 石蠟，冷凍，恒冷，超薄切片機(jī)５． 熒光，相差，倒置，自動(dòng)照相顯微鏡６． PCR儀－71—７． 細(xì)胞培養(yǎng)全套設(shè)備８． 熒光分光光度計(jì)９． 紫外分光光度計(jì) １０． LKB 電泳儀器１１． 低溫超速離心機(jī)１２． 超低溫冰箱，低溫冰柜１３． 超聲細(xì)胞粉碎儀１４． 去離子水發(fā)生器１５． 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用設(shè)備１６． 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)維持設(shè)施１７． 二氧化碳孵箱１８． 其他輔助設(shè)備１９． 其它本次實(shí)驗(yàn)需要，但缺少的設(shè)備，如DNA測(cè)序分析儀等可通過(guò)測(cè)序公司解決或聯(lián)系國(guó)家干細(xì)胞研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室解決。兒科研究所專業(yè)門類齊全，技術(shù)力量雄厚，設(shè)備完善，具有包括中心實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的涉及分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織病理學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)以及急救醫(yī)學(xué)、小兒腫瘤實(shí)驗(yàn)外科學(xué)等專業(yè)實(shí)驗(yàn)室、研究室十余個(gè)，能承擔(dān)國(guó)家重點(diǎn)科研課題及博士后研究工作。2. 已具備的實(shí)驗(yàn)條件，尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑（包括利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室的計(jì)劃與落實(shí)情況）本研究室所在的重慶醫(yī)科大學(xué)兒科研究所為原四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)已重新評(píng)定為重慶直轄市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，目前正在申報(bào)國(guó)家級(jí)及教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，是博士授權(quán)點(diǎn)并可培養(yǎng)博士后人員。（5） 本課題組成員已進(jìn)行了MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，并獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金資助（編號(hào)30070382）。（3） 對(duì)數(shù)百例先天性巨結(jié)腸癥患者進(jìn)行了診治，有較豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。－6－ 四、研究基礎(chǔ)1. 與本項(xiàng)目有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績(jī)（1） 本項(xiàng)目的提出源于課題組對(duì)先天性巨結(jié)腸癥長(zhǎng)期的臨床及基礎(chǔ)研究，既往主要將注意力集中在手術(shù)方法的改進(jìn)，病理生理學(xué)變化觀察上，已有多篇相關(guān)文章發(fā)表。（4） 2004年6月~2004年12月數(shù)據(jù)處理，完成論文。（2） 2003年1月~2003年12月完成神經(jīng)干細(xì)胞的各種基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，初步完成HD動(dòng)物模型的無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段的神經(jīng)干細(xì)胞注射及檢測(cè)。（2） 首次提出MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞后，移植分化修復(fù)HD正常神經(jīng)支配可能。(6) 課題組已成功進(jìn)行了神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定，及成人骨髓MSC體外擴(kuò)增和定向誘導(dǎo)分化為骨和軟骨細(xì)胞。(4) 較其它一些干細(xì)胞研究不同，神經(jīng)干細(xì)胞有明確的免疫標(biāo)記。(2) 本課題組已前期進(jìn)行了MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，同時(shí)成功進(jìn)行了體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的分離并獲得了國(guó)家自然科學(xué)基金支助（編號(hào)30070382）。 標(biāo)準(zhǔn)差表示，用F檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)，多因素方差分析進(jìn)行多組及組間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。6. 獲得神經(jīng)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染，移植，分化，重建HD正常神經(jīng)支配的方案 重復(fù)步驟1；2；3；4，反復(fù)調(diào)整。C 溫育5min，PCR，消減雜交，過(guò)柱子，PCR，消減雜交，TA克隆盒進(jìn)行DNA克隆，按說(shuō)明進(jìn)行，及進(jìn)行測(cè)序，基因鑒定等）。C溫育10min，加200U/ulMoMuLV反轉(zhuǎn)錄酶，37。逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，15umol/L dNTP, 10umol/L簡(jiǎn)并引物，65。B. RTPCR差異消減顯示：對(duì)分別將神經(jīng)干細(xì)胞移植處腸段及相同部位正常腸神經(jīng)組織分離擴(kuò)增出cDNA，運(yùn)用端帽子引物與端錨定引物，對(duì)cDNA進(jìn)行大量擴(kuò)增，正常腸神經(jīng)組織用生物素標(biāo)記的dATP和dNTPs進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行消減雜交，用連親和素去除共有產(chǎn)物，剩下的產(chǎn)物由帶有[a32 P]dATP的dNTPs進(jìn)行PCR，在重復(fù)差異顯示，回收差異條帶并克隆。A. 神經(jīng)干細(xì)胞移植處腸段及相同部位正常腸神經(jīng)組織RNA的純化：利用腸道組織的剝片技術(shù)獲取腸神經(jīng)組織，立即置放于液氮中，70保存。Ｅ．功能鑒定：直腸測(cè)壓技術(shù)，生物化學(xué)方法檢測(cè)r氨基丁酸，P物質(zhì)等的合成。Ｃ．免疫組化技術(shù)：檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞特異性烯醇化酶（NSE），Ｓ100，GAFP等表達(dá)。取移植處腸組織進(jìn)行檢測(cè)，分別按進(jìn)行檢測(cè)的項(xiàng)目要求對(duì)樣本進(jìn)行處理。2. 移植后的神經(jīng)干細(xì)胞在HD動(dòng)物體內(nèi)的分化誘導(dǎo) 維甲酸等分化誘導(dǎo)劑處理，藥物濃度選擇參考文獻(xiàn)。E. coli質(zhì)粒DNA大量制備、純化和酶切參照Sambrook等的文獻(xiàn)方法進(jìn)行；按LipofectamineTM試劑盒說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。2. 體外基因轉(zhuǎn)染 對(duì)于以上兩種來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞采用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將VMYC，EGF，及FGF2 ，PA，MMP cDNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，包括雙基因及單基因轉(zhuǎn)染的多種形式。B. 免疫組化或流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)化后的表面標(biāo)志: nestin, 波形蛋白，RC抗原。2. MSC向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化 參照文獻(xiàn)在MSC培養(yǎng)液中加入脊索中胚層浸出液，脊索中胚層條件培養(yǎng)液，星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液，多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子