zhou目的蛋白質(zhì)表達(dá)、純化、檢測-在線瀏覽
2025-06-24 12:14本頁面
【正文】 元件 ，就構(gòu)成了表達(dá)載體。 實(shí)驗(yàn)原理 ? 啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是對表達(dá)量有決定性影響的因素之一。 lac和 Tac， PL和PR， T7是最常用的啟動(dòng)子， ? 轉(zhuǎn)錄終止子 ? 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 啟動(dòng)子、終止子、核糖體識別序列 操縱子序列及配套的調(diào)控基因 ? 誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件 多克隆位點(diǎn) 復(fù)制起始序列 實(shí)驗(yàn)原理 ? 用作分離的載體蛋白被稱為 標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽 （ Tag） 。 ? 目前常用的標(biāo)簽有 – 組氨酸標(biāo)簽（ HisTag） – 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ glutathione S transferase）標(biāo)簽（ GSTTag） – 硫氧還蛋白（ thioredoxin, Trx）標(biāo)簽 – 麥芽糖結(jié)合蛋白（ Maltose Binding Protein, MBP） – 蛋白質(zhì) A（ protein A） – 纖維素結(jié)合位點(diǎn)（ cellulose binding domain）標(biāo)簽等。 實(shí)驗(yàn)原理 ? 篩選標(biāo)記 /報(bào)告基因表達(dá) ? 抗藥性基因， Amp是最常見的篩選標(biāo)記， kana，新霉素，四環(huán)素，紅霉素和氯霉素。 ? GFP（綠色熒光蛋白）是最常用的報(bào)告基因了，半乳糖苷酶，熒光素酶。 實(shí)驗(yàn)原理 ? 常用表達(dá)載體 – pGEX系列載體是谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ GST）融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的載體。 ? T7 ? Kana ? pET 14b 實(shí)驗(yàn)原理 ? 目的蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá) – lacI q（ Lactose） – lacI是大腸桿菌中 lac 操縱子（ Operon）的調(diào)節(jié)基因，它所表達(dá)的阻遏蛋白是 lac 操縱基因（ Operator）的抑制因子，抑制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。 – IPTG（異丙基 βD1硫代半乳糖苷 ) 作為乳糖的類似物與lacI阻遏蛋白結(jié)合而使操縱基因不被抑制，因此 IPTG經(jīng)常作為 lac 操縱子的誘導(dǎo)劑而使用。由于GST對谷胱甘肽的親和力非常高，因此可以利用谷胱甘肽固化于瓊脂糖形成的親和層析樹脂對 GST及其融合蛋白進(jìn)行純化，最后通過含有游離的谷胱甘肽的緩沖液 ,洗脫結(jié)合的 GST融合蛋白。 實(shí)驗(yàn)原理 ? 目的蛋白質(zhì)的檢測 – 蛋白質(zhì)分子量的檢測 – SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 – 目的蛋白質(zhì)的分析 實(shí)驗(yàn)原理 ? 十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDSPAGE）是目前用于測定蛋白質(zhì)分子量最好的方法。在樣品和凝膠中加入 SDS和還原劑后，強(qiáng)還原劑例如 β巰基乙醇和二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，通過加熱使蛋白質(zhì)解離。 實(shí)驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)中加入 SDS 并加熱， SDS 分子上的非極性區(qū) (黃色尾巴
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