【正文】 K。 7. 說明： 散點(diǎn)圖（ Dotplot），又稱二維散點(diǎn)圖是流式分析最常用圖譜，它可以顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)的相互關(guān)系。儀器使用者可因應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求來修改所有 圖譜中顯示之 參數(shù)。修改動(dòng)作為輕擊 圖譜上 X和 Y軸參數(shù) ，并 依需要選擇之（ FSC：細(xì)胞大小， SSC：細(xì)胞折射率， FL1： FITC綠色熒光， FL2： PE橙色熒光，F(xiàn)L3： PerCP紅色熒光 ）。點(diǎn)擊 OK，F(xiàn)L1/FL2的散點(diǎn)圖出現(xiàn)。 9. 在工具板中選擇 四象限工具 ，在 FL1/FL2散點(diǎn)圖上拖動(dòng) Quadrant的中心將它設(shè)定在（ x， y）＝（ 101， 101）處，這些象限將指定陰性 /陽性區(qū)域。如果無法選擇 Connect to Cytometer，參考秘技 1。 儀器設(shè)置文件 注意： 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，取決于最適化儀器設(shè)定文件。儀器設(shè)定文件（ Instrument settings），含信號(hào)器高壓（ Detector/ Amps）， 閾值（ Threshold），熒光補(bǔ)償（ Compensation）等 儀器條件的組合。 FACS101 Handbook 9 – 11. 檢查現(xiàn)有 儀器條件，從 Cytometer菜單中選擇Detectors/Amps。 在Detectors/Amps窗口確認(rèn) FSC與 SSC為 LIN（線性放大），其它 FL13為 LOG（對(duì)數(shù)放大），將其拖至空白區(qū)。將其拖至空白區(qū)。將其拖至空白區(qū)。確認(rèn)Acquisition Control 窗口中 ? Setup前需打叉或打勾 (即不儲(chǔ)存數(shù)據(jù) )，點(diǎn)擊Acquire。 FSC電壓 (Voltage)預(yù)設(shè)為 E00，可調(diào)節(jié) Amp Gain 從 — 使主要細(xì)胞群得以 清楚顯示（如細(xì)胞較大，將 FSC電壓設(shè)置于E1；較小細(xì)胞，將 FSC電壓設(shè)置于 E01）。調(diào)節(jié) FSC/SSC圖的原則，在于能得到一獨(dú)立離散的細(xì)胞族群，該細(xì)胞群不與其它族群、細(xì)胞碎片有重迭現(xiàn)象。 FACS101 Handbook 10 – Gating 圈選 細(xì)胞檢品中，常含有大小不同、性質(zhì)相異的細(xì)胞群體。 16. 在工具板中選 擇多邊形的 Region， 在 FSC/SSC散點(diǎn)圖上劃定淋巴細(xì)胞 R1 區(qū)域（如下圖）。如果要?jiǎng)h除 R1區(qū)域，您可以在工具欄中點(diǎn)選 Gates → Region list ，以鼠標(biāo)點(diǎn)選 R1，再按 Delete 鍵刪除 R1 區(qū)域。 17. 選取希望 Gate的 FL1/FL2散點(diǎn)圖， 從 Plots菜單中選擇 Format dot plot。點(diǎn)擊 OK。在 Detector/Amps 窗口中調(diào)節(jié)FL FL2的電壓，使 Negative Control細(xì)胞群著落在所選直方圖或散點(diǎn)圖之100101處。唯需注意不要切掉主要細(xì)胞族群。移去陰性對(duì)照管， 關(guān)閉Detector/Amps、 Threshold窗口，我們已設(shè)定好有意義細(xì)胞群之自體熒光。 （如是單色熒光實(shí)驗(yàn)可跳過此步驟） 如是2色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié) FL2%FL1， FL1%FL2（若 3色樣本，必要時(shí)需調(diào)節(jié) FL2%FL FL1%FL FL3%FL FL2%FL3的 補(bǔ)償）。點(diǎn)擊 Acquisition Control窗口中的 Acquire。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可通過點(diǎn)擊 ??來選擇或直接拖動(dòng)滑標(biāo)上下移動(dòng)。 22. 移去單染 CD3，換上單染 CD19PE管。調(diào)節(jié) FL1%FL2使 PE+細(xì)胞在 FL1/FL2散點(diǎn)圖的左上象限。 FACS101 Handbook 12 – 23. 最后以 CD3FITC/CD19PE雙染樣本上機(jī)，點(diǎn)擊 Acquisition Control窗口中的 Restart，確定三群細(xì)胞工整垂直。 24. 移去樣本管，換上 dH2O管，讓儀器暫且處于 Standby狀態(tài) 。您已完成 2色熒光之最適 化。如需修改，從Acquire菜單中選擇 Acquisition amp。 FACS101 Handbook 13 – 26. 找個(gè)檔案匣準(zhǔn)備儲(chǔ)存數(shù)據(jù) 。點(diǎn)擊 Folder，并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方 框，選擇「 Your Folder」或新建活頁夾，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的 Select ‘Your Folder‘。在 Custom Prefix中：輸入文件名 20202031，點(diǎn)擊此對(duì)話方框的 OK。 28. Optional：如有需要，可選擇或在 P1P5后的空格中輸入相關(guān)參數(shù)名。 輸入?yún)?shù)名會(huì)存入實(shí)驗(yàn)檔案中，顯示在圖譜上。 收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 30. 你可以開始 收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)了 。點(diǎn)擊“ Acquire‖ 便可啟動(dòng)樣品之分析測(cè)定與數(shù)據(jù) 儲(chǔ)存。等待下一指示?？衫^續(xù)分析直到所有檢品都分析完畢?？蓪浞莺笾?dāng)?shù)據(jù)，拿到另一蘋果計(jì)算機(jī)或個(gè)人 PC進(jìn)行離機(jī)分析。 退出軟件 34. 檢品分析完畢后，記得從屏幕上方 File 指令欄選擇 Save As，儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)文件，以備日后使用，不需每次重新編輯。點(diǎn)系 print打印此次實(shí)驗(yàn)條件，可貼入實(shí)驗(yàn)筆記留底，再點(diǎn)擊 Save以儲(chǔ)存此一實(shí)驗(yàn)的儀器條件，供日后再使用。點(diǎn)擊 Done。之后如不分析數(shù)據(jù)，您可退出軟件“ File” ?“ Quit” (遇有選項(xiàng)永遠(yuǎn)選擇“ Don?t save” )，進(jìn)行關(guān)機(jī)程序。改用 2 ml DI water。按 STANDBY五分鐘。該文件含有從流式細(xì)胞儀收取的平均 10,000個(gè)細(xì)胞數(shù)的資料，含有 4~6個(gè)參數(shù)。 開啟一 CellQuest實(shí)驗(yàn)文件 1. 從屏幕上方 File 菜單中選擇 New。 （雙色） 2. 從工具板中點(diǎn)擊散點(diǎn)圖圖示。 Plot 拖曳完成后可以在右方看到 Dot Plot對(duì)話框。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來打開次目錄，找到檔案后，點(diǎn)擊 Open來開啟 NORM001 檔案。 4. 工具板中選擇多角形區(qū)隔工具，將 Cursor 移至 FSC/SSC散點(diǎn)圖上，并沿著淋巴球聚落周邊畫出范圍，連點(diǎn)擊兩次可關(guān)閉該區(qū)域。 (如果要?jiǎng)h除 R1區(qū)域，您可以在工具欄中點(diǎn)選 Gates → Region list，以鼠標(biāo)點(diǎn)選 R1，再按 Delete 鍵刪除 R1 區(qū)域。 ) 5. 從 Plots菜單中選擇 Dot Plot可復(fù)制一個(gè)同樣大小的散點(diǎn)圖，屏幕上會(huì)出現(xiàn)一 Dot Plot 對(duì)話方框。從 Gate輸入欄中將 NoGate 改成 G1= R1。 NORM001 檔案為本組實(shí)驗(yàn)之陰性對(duì)照組，我們將以之來界定陰性與陽性之界限。 8. FL1/ FL2 二維散點(diǎn)圖現(xiàn)在被區(qū)隔出四個(gè)象限，欲計(jì)算各象線中細(xì)胞的數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)，從屏幕上方 Stats菜單中選擇 Quadrant Stats。UL：左上象限， UR：右上象限， LL：左下象 限， LR：右下象限 打印報(bào)告、輸出統(tǒng)計(jì)數(shù)值 9. 從屏幕上方 File菜單中選擇 Print One，可以打印工作中實(shí)驗(yàn)文件。在出現(xiàn)方框中命名檔案，并決定欲存放檔案匣，點(diǎn)擊 Save。 12. 對(duì)于 存在不同檔案匣之系列檔案，可用鼠標(biāo)以拖曳方式選取所有圖表 (文件中所有圖譜的四角會(huì)出現(xiàn)黑色方塊，表示被選擇上 ) ，接著從 Plots菜單選擇 Change Data Files，并在隨后出現(xiàn)之對(duì)話方框，選擇所在新目錄與欲分析 檔案 ?？烧{(diào) 整圈選區(qū)域， Quadrant Marker陰陽界限，軟件會(huì)重新計(jì)算、統(tǒng)計(jì)報(bào)告。 FACS101 Handbook 19 – （單色） 1. 從屏幕上方 File 菜單中選擇 New。 2. 從工具板中點(diǎn)擊散 點(diǎn)圖圖示。 Plot 拖曳完成后可以在右方看到 Dot Plot對(duì)話框。連續(xù)雙擊鼠標(biāo)來打開次目錄，找到檔案后，點(diǎn)擊 Open來開啟 NORM001 檔案。